牛多殺性巴氏桿菌病二價(jià)滅活疫苗的研究

姜志剛，徐和敏，邵 葳，潘春剛，于 力*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 牛羊傳染病研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，黑龍江 哈爾濱 150069；2.中牧實(shí)業(yè)股份有限公司，北京 100070)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida，Pm)是具有異質(zhì)性特征的革蘭氏陰性病原菌群，一般寄生于家養(yǎng)和野生動(dòng)物的上呼吸道，具有條件致病性，在某些應(yīng)激條件刺激下，可以引起帶菌動(dòng)物發(fā)生以敗血和/ 或呼吸系統(tǒng)疾患為主的疾病[1]。根據(jù)莢膜抗原的特異性，可將 Pm 分為 A、B、D、E 和 F 等 5個(gè)莢膜型[2]。莢膜 A 型和莢膜 B 型 Pm 是引起我國(guó)牛巴氏桿菌病的病原。其中莢膜B 型Pm 引起的牛出血性敗血癥是牛的重要疫病[3]，牛莢膜A 型 Pm是2008年首次被分離鑒定的引起牛纖維素性化膿性肺炎的新病原[4-8]，是近10年來(lái)嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)牛產(chǎn)業(yè)的新發(fā)疫情[7]。由于Pm 不同血清型之間的交叉保護(hù)力差[3]，現(xiàn)有的牛出血性敗血癥滅活疫苗(莢膜B 型Pm 單價(jià)苗)不能有效防控莢膜A 型Pm 引起的牛纖維素性化膿性肺炎。因此，研發(fā)針對(duì)莢膜A 型Pm 的滅活疫苗是必要而緊迫的。

本研究團(tuán)隊(duì)前期研究已經(jīng)確定了牛莢膜A 型Pm 與牛纖維素性化膿性肺炎因果關(guān)系[7]，并且建立了莢膜 A 型 Pm 的牛體免疫攻毒模型[8]；同時(shí)，參考現(xiàn)行的《 牛多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗制造及檢驗(yàn)規(guī)程》(莢膜 B 型 Pm 單價(jià)苗)[9]，重新測(cè)定了牛莢膜B 型疫苗菌株對(duì)牛的最小致死量(MLD)以及最小免疫劑量(未發(fā)表資料)。在上述研究的基礎(chǔ)上，本研究將毒力強(qiáng)、免疫原性好的牛莢膜A 型Pm-TJ株，與已商品化的牛莢膜B 型Pm 滅活苗生產(chǎn)用菌株C45-2 株(CVCC 44502)作為制苗菌種，制備牛莢膜Pm 病二價(jià)滅活疫苗，并對(duì)該制品的安全性、免疫效力、免疫持續(xù)期進(jìn)行研究，為全面控制我國(guó)牛巴氏桿菌病提供有效的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 菌株、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑 牛莢膜A 型Pm-TJ 株(簡(jiǎn)稱(chēng) Pm-TJ 株)由哈爾濱獸醫(yī)研究所保存并提供；牛莢膜 B 型 Pm C45-2 株(簡(jiǎn)稱(chēng) C45-2 株)由中牧蘭州生物藥廠(chǎng)保存并提供。體質(zhì)量為1.5 kg～2.0 kg 的家兔由中牧實(shí)業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠(chǎng)自繁自養(yǎng)；體質(zhì)量為 18 g～22 g SPF 級(jí) BALB/c小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；6月齡西門(mén)塔爾雜交肉牛(西雜牛)和3 歲齡荷斯坦奶牛分別來(lái)自重慶某肉牛場(chǎng)和甘肅某奶牛場(chǎng)。腦心浸液培養(yǎng)基和馬丁肉湯培養(yǎng)基均購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氫氧化鋁膠佐劑由中牧蘭州生物藥廠(chǎng)配制。

1.2 Pm 二價(jià)滅活疫苗的制備 取Pm-TJ 株活化菌液按 2 %量接種于 BHI 培養(yǎng)基，置 37 ℃、75 r/min培養(yǎng) 8 h 后收獲；同時(shí)，取 C45-2 株活化接種于含0.1 %裂解血球全血的馬丁肉湯中，37 ℃培養(yǎng)12 h后收獲。對(duì)收獲的兩種菌液分別進(jìn)行純粹性檢驗(yàn)和活菌計(jì)數(shù)后離心濃縮，分別加入0.1 %甲醛溶液于37 ℃滅活12 h，滅活檢驗(yàn)合格后將菌液與氫氧化鋁膠佐劑按5∶1 的比例混勻分別制成滅活疫苗，混合兩種滅活疫苗，使Pm-TJ 株和C45-2 株的終濃度分別為 1×1010cfu/mL 和 5.0×109cfu/mL，制備 Pm 二價(jià)滅活疫苗。

1.3 Pm 二價(jià)滅活疫苗的安全性試驗(yàn)

1.3.1 非靶動(dòng)物安全性試驗(yàn) 將制備的Pm 二價(jià)滅活疫苗分別皮下接種10 只小鼠和10 只家兔，參考現(xiàn)行的 《 牛多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗制造及檢驗(yàn)規(guī)程》(莢膜 B 型 Pm 單價(jià)苗)，分別接種 0.3 mL/ 只和 4 mL/ 只[9]，同時(shí)設(shè)置相同數(shù)量的未接種動(dòng)物作為對(duì)照，10 d 內(nèi)觀(guān)察動(dòng)物的接種部位、精神狀態(tài)及存活情況。

1.3.2 靶動(dòng)物安全性試驗(yàn) 將制備的Pm 二價(jià)滅活疫苗分別以單劑量(2 mL/ 頭)、單劑量重復(fù)(間隔 2周)以及超劑量(4 mL/ 頭)經(jīng)肌肉途徑分別接種10 頭6月齡西雜牛以及3 歲齡10 頭荷斯坦奶牛，同時(shí)設(shè)置相同數(shù)量的未接種動(dòng)物作為對(duì)照。于接種后每日測(cè)量動(dòng)物體溫、觀(guān)察動(dòng)物的接種部位和精神狀態(tài)，并記錄存活情況，觀(guān)察期為14 d。為評(píng)價(jià)疫苗對(duì)牛生產(chǎn)性能的影響，在觀(guān)察期內(nèi)每日記錄荷斯坦奶牛的產(chǎn)奶量；于免疫前和免疫后30 d 測(cè)量西雜牛的體重，并計(jì)算月增重。

1.4 Pm 二價(jià)滅活疫苗對(duì)牛的免疫保護(hù)試驗(yàn) 將24頭6月齡西雜牛隨機(jī)分為 3組，每組 8 頭，分別以每頭 2.0 mL、1.0 mL 和 0.5 mL 的 Pm 二價(jià)滅活疫苗頸部肌肉注射接種每組實(shí)驗(yàn)牛，另設(shè)6 頭未接種疫苗牛作為對(duì)照組。接種后第21 d，隨機(jī)選擇各實(shí)驗(yàn)組4 頭牛和對(duì)照組3 頭牛經(jīng)氣管接種Pm-TJ 強(qiáng)毒株(5.3×108cfu/ 頭)，每日觀(guān)察牛的臨床表現(xiàn)，于攻毒后第10 d 剖檢、記錄肺部病理變化，并進(jìn)行細(xì)菌再分離及PCR 鑒定[7]。根據(jù)本團(tuán)隊(duì)前期的病原菌回歸牛體致病試驗(yàn)結(jié)果[7-8]，本研究對(duì)攻毒牛的臨床癥狀及病理變化打分評(píng)價(jià)該二價(jià)滅活疫苗對(duì)免疫牛的保護(hù)效果。各實(shí)驗(yàn)組另4 頭牛與對(duì)照組另3 頭牛采用肌肉注射 C45-2 強(qiáng)毒株(5.2×106cfu/ 頭)[9]攻毒，觀(guān)察14日。參照 《 牛多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗制造及檢驗(yàn)規(guī)程》(莢膜 B 型 Pm 單價(jià)苗)[9]，本研究將二價(jià)滅活疫苗免疫效力的標(biāo)準(zhǔn)確定為：若攻毒后對(duì)照組牛全部(3/3)發(fā)病(A 型菌攻毒)或死亡(B 型菌攻毒)時(shí)，免疫牛應(yīng)至少3/4 獲得保護(hù)；若攻毒后對(duì)照牛2/3 發(fā)病或死亡，免疫牛應(yīng)全部(4/4)獲得保護(hù)。根據(jù)攻毒后牛的存活情況評(píng)價(jià)疫苗接種對(duì)攻毒牛的保護(hù)效果。

1.5 Pm 二價(jià)滅活疫苗接種牛免疫持續(xù)期的測(cè)定將Pm 二價(jià)滅活疫苗肌肉接種32 頭西雜牛，2.0 mL/頭，同時(shí)設(shè)24 頭未免疫牛作為對(duì)照。在免疫后3、6、9 和 10 個(gè)月，分別對(duì)免疫牛和對(duì)照牛攻毒。即在每個(gè)攻毒時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)挑選4 頭免疫牛和3 頭對(duì)照牛攻擊A 型菌Pm-TJ 株，另隨機(jī)挑選4 頭免疫牛和3 頭對(duì)照牛攻擊B 型菌C45-2 株攻毒，攻毒方法同1.4。統(tǒng)計(jì)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的攻毒保護(hù)結(jié)果，確定該疫苗的免疫持續(xù)期。

2 結(jié) 果

2.1 二價(jià)滅活疫苗安全性試驗(yàn)結(jié)果 將制備的Pm二價(jià)滅活疫苗皮下接種非靶動(dòng)物小鼠和兔，觀(guān)察期內(nèi)接種動(dòng)物均健活，未出現(xiàn)精神萎靡以及接種部位紅腫、結(jié)節(jié)等不良反應(yīng)，與未接種動(dòng)物無(wú)可見(jiàn)差異。將疫苗分別以單劑量、單劑量重復(fù)以及超劑量接種西雜肉牛及荷斯坦奶牛。觀(guān)察期內(nèi)所有接種牛均健活，未出現(xiàn)體溫升高、精神萎靡以及接種部位紅腫、結(jié)節(jié)等不良反應(yīng)，與對(duì)照牛無(wú)可見(jiàn)差異。此外，本研究還通過(guò)測(cè)量6月齡肉犢牛月增重以及3歲泌乳牛日產(chǎn)奶量來(lái)評(píng)價(jià)疫苗對(duì)免疫牛生產(chǎn)性能的影響，結(jié)果顯示，將疫苗以一次單劑量、單劑量重復(fù)以及一次超劑量免疫肉犢牛后，犢牛在首免后30 d內(nèi)平均月增重分別為 17.0 kg、16.3 kg、17.1 kg，對(duì)照組犢牛平均月增重為16.7 kg (圖1A)，免疫組與對(duì)照組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t 檢驗(yàn)，p＞0.05)；采用該3 種方式接種泌乳牛，14 d 內(nèi)觀(guān)察每日產(chǎn)奶量，方差分析顯示免疫組與對(duì)照組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05) (圖1B)。上述結(jié)果表明，制備的牛 Pm 病二價(jià)滅活疫苗具有良好的安全性。

圖1 接種二價(jià)滅活疫苗對(duì)牛生產(chǎn)性能的影響Fig.1 Effect of the bivalent inactivated vaccine inoculation on production performance of cattle

2.2 二價(jià)滅活疫苗對(duì)牛的免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果 將二價(jià)滅活疫苗分別以每頭2.0 mL、1.0 mL 和 0.5 mL的劑量經(jīng)頸部肌肉途徑接種實(shí)驗(yàn)牛，于免疫后21 d分別以 Pm-TJ 株和 C45-2 株強(qiáng)毒攻擊，結(jié)果顯示，當(dāng)免疫劑量為2 mL/ 頭時(shí)，免疫犢牛無(wú)論用A 型菌還是B 型菌攻毒，保護(hù)率均能達(dá)到100 % (4/4)；當(dāng)免疫劑量降低至1 mL/ 頭時(shí)，免疫犢牛用A 型菌攻毒后的保護(hù)率可達(dá)75 % (3/4)，用B 型菌攻毒后的保護(hù)率仍能夠達(dá)到 100 % (4/4)；用 0.5 mL 疫苗免疫犢牛后，其對(duì)A 型和B 型菌攻毒后的保護(hù)率均為25%(1/4)；未免疫的對(duì)照犢牛用A 型菌攻毒后100%(3/3)發(fā)生纖維素性化膿性肺炎，用 B 型菌攻毒后100 % (3/3)發(fā)生牛出血性敗血癥而死亡，結(jié)果詳見(jiàn)表1。表明二價(jià)滅活疫苗能夠同時(shí)保護(hù)對(duì)莢膜A 型和B 型Pm 的攻擊產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)，且最小免疫劑量為1 mL/ 頭份。

表1 二價(jià)滅活疫苗對(duì)犢牛免疫效力的評(píng)價(jià)Table 1 Evaluation of immune potency of the bivalent inactivated vaccine for calves

2.3 二價(jià)滅活疫苗對(duì)牛的免疫持續(xù)期測(cè)定結(jié)果 將本研究疫苗制品按推薦劑量(2 mL/ 頭份)接種西雜牛，在接種疫苗后分別于不同時(shí)段采用A 型Pm-TJ株和 B 型C45-2 株對(duì)免疫牛進(jìn)行攻擊，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)牛在免疫后各時(shí)段對(duì)A 型菌和B 型菌的攻毒保護(hù)率均能夠達(dá)到75 % (3/4)及以上(表2)，符合免疫效力標(biāo)準(zhǔn)。表明該二價(jià)滅活疫苗免疫10 個(gè)月內(nèi)能夠同時(shí)對(duì)A 型菌和B 型菌的攻擊提供有效保護(hù)，疫苗免疫持續(xù)期至少10 個(gè)月。

表2 二價(jià)滅活疫苗對(duì)犢牛免疫持續(xù)期的測(cè)定Table 2 Immune duration of the bivalent inactivated vaccine-inoculated calves

3 討 論

本研究按照獸用新生物制品研制的要求，對(duì)制備的牛 Pm A 型 Pm-TJ 株和 B 型 Pm C45-2 株二價(jià)滅活疫苗開(kāi)展了安全性和免疫效力的研究，為該疫苗產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化研發(fā)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

在疫苗研究中，用非靶動(dòng)物替代本動(dòng)物進(jìn)行安全性檢驗(yàn)，在保證疫苗安全檢驗(yàn)要求的前提下，可以減少本動(dòng)物安全性檢驗(yàn)中牛的使用，這不僅符合動(dòng)物倫理方面的要求，同時(shí)也可以降低批次檢驗(yàn)的成本。在現(xiàn)行《 牛多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗制造及檢驗(yàn)規(guī)程》[9](莢膜B 型Pm 單價(jià)苗)的安全性檢驗(yàn)中，小鼠和兔均采用皮下注射，小鼠接種劑量為0.3 mL，兔接種劑量為本動(dòng)物的1 倍劑量，即5.0 mL；本制品采用了小鼠安全檢驗(yàn)的方法，而用兔檢驗(yàn)時(shí)接種劑量提高至本動(dòng)物使用劑量的2 倍，即4.0 mL(本制品為濃縮苗，本動(dòng)物推薦使用劑量為2 mL)，因此本研究中的安全性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)更高、結(jié)果更加可靠。

在本動(dòng)物牛的安全性和免疫效力研究中，接種劑量以及攻毒劑量的確定，是依據(jù)前期研究中建立的莢膜A 型Pm 免疫攻毒模型結(jié)果[8]，以及中牧蘭州生物藥廠(chǎng)對(duì)莢膜B 型Pm 的毒力與免疫原性重新測(cè)定的結(jié)果(未發(fā)表資料)。在攻毒試驗(yàn)中，用莢膜A 型和莢膜B 型Pm 攻擊時(shí)采用不同的標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果，這是由于兩種血清型細(xì)菌對(duì)牛的致病性明顯不同。B 型菌侵入牛體形成敗血癥，引起全身性多系統(tǒng)病理變化導(dǎo)致其急性死亡，因此建立攻毒模型是以牛死亡作為判定指標(biāo)，效力試驗(yàn)依然參照現(xiàn)行的《 牛多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗制造及檢驗(yàn)規(guī)程》[9](B 型 Pm 單苗)操作。與之明顯不同的是，莢膜 A型Pm 人工感染牛所引起的病理變化局限在肺臟，呈現(xiàn)纖維素性化膿性肺炎，無(wú)全身性病理變化，在無(wú)明顯應(yīng)激因素刺激時(shí)，多數(shù)牛呈現(xiàn)亞急性或慢性發(fā)病，短期內(nèi)不會(huì)引起死亡，因此建立攻毒模型是以臨床癥狀、病理變化結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)對(duì)發(fā)病牛進(jìn)行判定[7-8]。免疫后攻毒結(jié)果顯示，接種二價(jià)滅活疫苗可使?fàn)倥Ｍ瑫r(shí)抵抗莢膜 A 型 Pm 和莢膜B 型 Pm的攻擊，其最小免疫劑量為1 mL。然而，考慮到牛莢膜A 型Pm 屬于典型的條件致病性病原，現(xiàn)地牛背景復(fù)雜而且易受多種應(yīng)激因素的影響，為保證疫苗的免疫效果，在實(shí)際應(yīng)用中將接種劑量定為2 mL/ 頭。

在免疫持續(xù)期的研究中，考慮到現(xiàn)有牛Pm 病滅活疫苗(莢膜B 型Pm 單價(jià)苗)產(chǎn)品的免疫持續(xù)期為9 個(gè)月，本研究將持續(xù)期試驗(yàn)的攻毒時(shí)間節(jié)點(diǎn)定為 3、6、9、10 個(gè)月。結(jié)果顯示，犢牛接種疫苗后10 個(gè)月仍能夠同時(shí)抵抗 A 型和B 型Pm 的攻擊，可見(jiàn)該疫苗免疫持續(xù)期至少可達(dá)到10 個(gè)月，這也與預(yù)期相符。然而，考慮到牛群中其它病原混合感染等應(yīng)激因素，為保證牛持續(xù)處于最佳免疫狀態(tài)，在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，二價(jià)滅活疫苗的免疫持續(xù)期定為9 個(gè)月。

綜上所述，本研究在前期建立的莢膜A 型Pm免疫攻毒模型的基礎(chǔ)上，聯(lián)合A 型和B 型Pm 菌株研制牛Pm 病二價(jià)滅活疫苗，該二價(jià)疫苗對(duì)牛安全、有效，可以同時(shí)預(yù)防牛纖維素性化膿性肺炎和牛出血性敗血癥，該疫苗將對(duì)全面有效地控制我國(guó)的牛多Pm 病疫情具有重要價(jià)值。