畢秋蕓

(淄博職業(yè)學院，山東 淄博 255314)

隨著人們對陸地資源的不斷開發(fā)，人們可利用的資源越來越少，其中很多資源已面臨枯竭的危險。而相比之下，海洋中蘊含的資源極其豐富，對海洋生物資源的開發(fā)利用至今仍是人類涉及不多的領(lǐng)域，所以海洋生物資源的開發(fā)潛力巨大。裙帶菜屬褐藻門、裙帶菜屬，是經(jīng)濟價值很高的大型褐藻，蛋白質(zhì)含量較高，約占藻體的16%左右，僅次于龍須菜和紫菜[1]，是我國北方大規(guī)模栽培的主要藻類。但目前，我國對裙帶菜的開發(fā)主要以提取海藻酸鈉和碘為主，利用率僅達30%左右，大部分裙帶菜蛋白成了加工廢棄物，未得到有效利用[2]，造成了資源的極大浪費。近年來，隨著對海洋資源的不斷開發(fā)，海藻抗氧化肽迅速成為國內(nèi)外專家學者研究的熱點，部分學者已從海藻中分離得到多種可清除體內(nèi)自由基、具有抗氧化作用的海藻活性肽[3]，顯示了海藻類蛋白能夠作為水溶性抗氧化劑的新資源，但對裙帶菜蛋白酶解制備抗氧化肽的研究還相對較少，僅有于慧等在2017年探究了響應面試驗優(yōu)化裙帶菜蛋白酶解工藝，并研究了酶解產(chǎn)物的抗氧化活性，顯示裙帶菜多肽具有較強的亞鐵離子螯合能力[4]。本實驗利用多種蛋白酶水解裙帶菜蛋白，在酶解單因素試驗基礎(chǔ)上，運用正交試驗法對水解工藝條件進行了優(yōu)化，得到裙帶菜多肽的最佳制備條件。并對酶解后的裙帶菜多肽進行了超濾分級，研究分級后不同分子量段的裙帶菜多肽的抗氧化活性，為裙帶菜的深加工提供了一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮裙帶：購于海貨市場，洗凈曬干后，用組織粉碎機粉碎，包裝密封，于陰涼干燥處保存。

復合蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶：丹麥諾維信有限公司；堿性蛋白酶、胃蛋白酶：杰能科(中國)生物工程有限公司；DPPH、菲洛嗪：美國Sigma公司；抗壞血酸、三氯乙酸、三氯化鐵、鐵氰化鉀、無水乙醇等：均為分析純。

1.2 儀器和設備

1.3 實驗方法

1.3.1 裙帶菜蛋白質(zhì)的提取方法

將裙帶菜洗凈、去雜，50 ℃恒溫烘干粉碎，過60目篩，加入一定量的石油醚脫脂2次，每次6 h，脫脂后于50 ℃烘干恒重。稱取一定量的脫脂粉末，放入圓底燒瓶，按照液料比23∶1的比例加入質(zhì)量分數(shù)2.2%的氫氧化鈉溶液在55 ℃的溫度條件下提取5 h后過濾，向濾液中加入鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.0，在4000 r/min條件下離心20 min，得沉淀，冷凍干燥后即為裙帶菜蛋白。

1.3.2 裙帶菜多肽的制備方法

一定量的裙帶菜蛋白質(zhì)→加緩沖溶液→調(diào)節(jié)至酶解條件→酶解→85 ℃滅酶15 min→5000 r/min離心20 min→取上清液→冷凍干燥→裙帶菜多肽。

1.3.3 還原力的測定

取一定量的裙帶菜多肽，加入3.5 mL 0.2 mol/L的磷酸緩沖液(pH 6.6)、2.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液，混勻后于50 ℃水浴保溫30 min，再加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，混勻后于3000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液，混勻，靜置10 min后，于波長700 nm處測定其吸光度，記為酶解液的還原力。吸光度越大，表示還原能力越強[5]。

1.3.4 裙帶菜多肽超濾分級

取一定量的裙帶菜蛋白質(zhì)溶于水中，調(diào)節(jié)體系pH至7.0，沉淀未反應的蛋白，經(jīng)4000 r/min離心。在室溫條件下，使用Pellicon-2超濾裝置對上清液進行超濾分離，進行多步分級(截留分子量Mw>10 kDa，5～10 kDa，3～5 kDa，1～3 kDa，<1 kDa)。

1.3.5 裙帶菜多肽清除DPPH自由基能力和亞鐵離子螯合能力的測定

配制一定濃度的裙帶菜多肽液，按照于慧等的方法進行測定。

1.3.6 裙帶菜多肽·OH清除能力和O2-·清除能力的測定

配制一定濃度的裙帶菜多肽液，按照齊希光等的方法進行測定[6]。

1.3.7 裙帶菜多肽分子量分布的測定

裙帶菜多肽的分子量測定方法及條件設置參照張友維[7]的方法。

1.3.8 裙帶菜多肽氨基酸組成的測定

裙帶菜多肽的氨基酸組成測定，以外標法于安捷倫AG1100型氨基酸專用液相色譜儀進行定量分析，具體樣品預處理和測定方法參照郭旭[8]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 裙帶菜蛋白質(zhì)組分分析

表1 裙帶菜蛋白質(zhì)組成成分分析Table 1 The composition analysis of Undaria pinnatifida protein g/100 g

由表1可知，干裙帶菜中的主要成分為蛋白質(zhì)和多糖，其中蛋白質(zhì)的含量為12.11 g/100 g，多糖的含量為38.27 g/100 g。經(jīng)過本實驗提取后的裙帶菜蛋白的純度可達到83.21 g/100 g。

2.2 裙帶菜蛋白質(zhì)酶解單因素試驗

2.2.1 蛋白酶種類及酶解時間對裙帶菜多肽抗氧化活性的影響

按照一定的料液比和加酶量，分別加入木瓜蛋白酶、復合蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶，分別于各自的最適酶解條件下，酶解1，2，3，4，5，6 h后，于85 ℃滅酶15 min，離心后取其上清液，冷凍干燥，測定其總還原力。

由圖1可知，隨著酶解時間的不斷延長，5種酶酶解制備的裙帶菜多肽的總還原力呈現(xiàn)先增加后逐漸降低的趨勢。堿性蛋白酶酶解制備的裙帶菜多肽的總還原力明顯高于其他4種酶。其中木瓜蛋白酶和中性蛋白酶酶解制備的裙帶菜多肽的還原力相對較弱，復合蛋白酶和胃蛋白酶酶解制備的裙帶菜多肽的還原力處于5種酶的中等水平，堿性蛋白酶酶解制備的裙帶菜多肽的還原力最強。其中堿性蛋白酶酶解3 h后制備的裙帶菜多肽的總還原力最高，吸光值達到0.321。因此，選擇堿性蛋白酶作為單因素試驗的最佳酶解用酶，3 h為最佳酶解時間。

圖1 酶種類及酶解時間對裙帶菜多肽還原能力的影響Fig.1 The influence of enzyme types and enzymatic hydrolysis time on reduction ability of Undaria pinnatifida peptides

2.2.2 料液比對裙帶菜多肽抗氧化活性的影響

選擇堿性蛋白酶，按照1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%的料液比，按照一定的加酶量，在堿性蛋白酶理論最適pH值和溫度條件下水浴反應3 h，制備裙帶菜多肽，并測定其總還原力。

圖2 料液比對裙帶菜多肽還原能力的影響Fig.2 The influence of solid-to-liquid ratio on reduction ability of Undaria pinnatifida peptides

由圖2可知，料液比在1%～4%范圍內(nèi)，隨著料液比的不斷增大，裙帶菜多肽的還原力不斷增強，當料液比高于4%時，隨著濃度的增加，裙帶菜多肽的還原力趨于平穩(wěn)。這是因為料液比較低的情況下，底物濃度不足，酶解制備的具有還原能力的裙帶菜多肽的含量較低，此時，隨著料液比的不斷增加，酶解制備的裙帶菜多肽的還原能力不斷提高。當料液比達到4%時，底物濃度充足，堿性蛋白酶不足，因此，此時增加料液比，不能提高制備的裙帶菜多肽的還原能力。因此，選擇4%的料液比作為酶解反應單因素試驗的最佳料液比。

2.2.3 加酶量對裙帶菜多肽抗氧化活性的影響

選擇堿性蛋白酶，在料液比4%的條件下，按照1000，3000，5000，7000，9000，11000，13000 U/g的加酶量加入堿性蛋白酶，在堿性蛋白酶理論最適pH值和溫度條件下，振蕩水浴中反應3 h，制備裙帶菜多肽，并測定其總還原力。

圖3 加酶量對裙帶菜多肽還原能力的影響Fig.3 The influence of enzyme amount on reduction ability of Undaria pinnatifida peptides

由圖3可知，加酶量對裙帶菜多肽總還原力的影響較大，隨著加酶量的不斷增加，制備的裙帶菜多肽的總還原力呈現(xiàn)先增加后逐漸穩(wěn)定的趨勢。當堿性蛋白酶的加酶量為1000 U/g時，制備的裙帶菜多肽的總還原力最低，吸光值為0.216。當加酶量增加至7000 U/g時，裙帶菜多肽的還原力基本達到最高，此時的吸光值為0.362。繼續(xù)提高加酶量，對制備的裙帶菜多肽的總還原力影響不大。這是因為在1000～7000 U/g的加酶量范圍內(nèi)，底物濃度充足，堿性蛋白酶含量不足，酶解后產(chǎn)生的抗氧化性多肽較少，隨著加酶量的不斷增加，酶解后產(chǎn)生的抗氧化活性肽逐漸增加，制備裙帶菜多肽的總還原力不斷提高。而酶用量增大到一定量時，酶分子間碰撞的機會增加，會引起酶自溶，不利于酶促反應的進行[9]，因此，選擇7000 U/g作為酶解反應單因素試驗的最佳加酶量。

2.2.4 pH對裙帶菜多肽抗氧化活性的影響

選擇堿性蛋白酶，在加酶量7000 U/g、料液比4%的條件下，按照不同pH值(8.5，9，9.5，10，10.5，11，11.5)，在堿性蛋白酶理論最適溫度下振蕩水浴反應3 h，制備裙帶菜多肽，并測定其總還原力。

圖4 pH對裙帶菜多肽還原能力的影響Fig.4 The influence of pH on reduction ability of Undaria pinnatifida peptides

由圖4可知，隨著體系pH的逐漸增大，制備的裙帶菜多肽的總還原力呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。這是因為堿性蛋白酶對體系的pH變化敏感，不同pH下結(jié)構(gòu)會發(fā)生一定的變化，酶切活性隨之不同[10]。當pH為8.5時，堿性蛋白酶的活力較低，酶解后產(chǎn)生的裙帶菜多肽的抗氧化活性最低，吸光值僅為0.265。隨著pH的逐漸升高，堿性蛋白酶的酶活逐漸增加，另外，裙帶菜蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)在堿性條件下逐漸打開，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得更加松散，蛋白酶更容易于酶切位點結(jié)合，對酶解作用有利，使得酶解更加充分，進而增加了制備后的多肽的總還原力，當pH為10.0時還原力達到最大值，此時吸光值為0.381。當pH高于10.0時，體系pH過高，堿性蛋白酶活性降低，進而導致制備后的多肽的總還原力降低。因此，選擇pH 10.0為單因素試驗的最佳pH值。

2.2.5 溫度對裙帶菜多肽抗氧化活性的影響

裙帶菜蛋白在加酶量為7000 U/g、料液比為4%、pH為10.0的條件下，分別在40，45，50，55，60，65，70 ℃振蕩水浴酶解3 h，制備裙帶菜多肽，并測定其總還原力。

由圖5可知，在一定溫度范圍內(nèi)，隨著酶解溫度的升高，裙帶菜多肽的還原能力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當酶解溫度為55 ℃時，制備后的裙帶菜多肽的還原力達到最大值，此時吸光值為0.396。當酶解溫度超過55 ℃時，裙帶菜多肽的抗氧化活性呈下降趨勢?？梢?，在酶解過程中，適當提高溫度可增加酶的活力，促進抗氧化肽的產(chǎn)生，但若溫度過高，酶蛋白變性，酶的穩(wěn)定性下降，酶解效率也隨之降低。因此，裙帶菜蛋白的酶解溫度以55 ℃為宜。

圖5 溫度對裙帶菜多肽還原能力的影響Fig.5 The influence of enzymolysis temperature on reduction ability of Undaria pinnatifida peptides

2.3 裙帶菜蛋白質(zhì)酶解正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以裙帶菜多肽的總還原力為指標，在固定料液比為4%的條件下，以酶解時間、酶解溫度、加酶量及pH為因素，通過四因素三水平的正交試驗對酶解條件進行優(yōu)化，見表2。

表2 正交試驗因素水平表Table 2 The factors and levels of orthogonal test

表3 正交結(jié)果分析Table 3 The results of orthogonal test

由表3極差R1可知，影響裙帶菜多肽總還原力的各因素主次順序為A>D>C>B。因此，酶解溫度對裙帶菜多肽還原力的影響最大。根據(jù)各試驗因子的平均數(shù)可知，在所選的因素水平下，水解最佳組合為A2B3C3D2。

按照正交試驗優(yōu)化的酶解條件：酶解溫度55 ℃、酶解時間3.5 h、加酶量7500 U/g、pH 10.0條件下，分別進行3次裙帶菜蛋白酶解試驗，制備裙帶菜多肽，并測定其總還原力，平均吸光值為0.411。

2.4 裙帶菜多肽的超濾分級

2.4.1 裙帶菜多肽組成成分分析

表4 裙帶菜多肽成分分析Table 4 Analysis of polypeptide components of Undaria pinnatifida g/100 g

由表4可知，經(jīng)最優(yōu)條件酶解制備的裙帶菜多肽的組分為多肽含量72.5 g/100 g，多糖含量0.34 g/100 g，灰分含量26.79 g/100 g，其他0.37 g/100 g。

2.4.2 裙帶菜多肽分子量分布分析

酶解制備的裙帶菜多肽的分子量分布見圖6。

圖6 裙帶菜多肽的平均分子量分布Fig.6 The average molecular weight distribution of Undaria pinnatifida polypeptides

由圖6可知，裙帶菜多肽主要是由低分子量的肽段組成，其中低于1 kDa分子量肽段部分占總峰面積的77.63%。

2.4.3 不同分子量裙帶菜多肽的氨基酸組成

將裙帶菜多肽進行超濾分級，依照截留孔徑的大小，裙帶菜多肽可分成5個組分，分子量大小如下：UPPs-L(Mw<1 kDa)、UPPs-1(Mw=1～3 kDa)、UPPs-3(Mw=3～5 kDa)、UPPs-5(Mw=5～10 kDa)、UPPs-10(Mw>10 kDa)，對超濾后的5個裙帶菜多肽組分進行氨基酸分析，結(jié)果見表5。

表5 各組分氨基酸分析Table 5 Amino acid analysis of each component

續(xù) 表

不同分子量肽段中氨基酸種類與組成的不同，在一定程度上影響了裙帶菜多肽抗氧化活性的大小。如含硫氨基酸Cys和Met，含咪唑基的氨基酸His等，因具有親核性可作為氫受體，提高肽段的抗氧化活性。芳香族氨基酸可以參與供氫，減慢或終止自由基鏈式反應，提高肽段的抗氧化活性，Glu可以作為氫供體提高肽類物質(zhì)的還原能力等[11]。因此，分析不同分子量裙帶菜多肽的氨基酸組成，對分析其抗氧化性具有重要的意義。由表5可知，不同分子量的裙帶菜多肽中的氨基酸組成不同，其中UPPs-L中疏水性氨基酸含量達到44.41 g/100 g，對多肽片段的抗氧化性有利，其His含量占3.97 g/100 g，高于其他組分，由此可以推測該片段具有較強的抗氧化活性。

2.5 不同分子量裙帶菜多肽的抗氧化活性測定

裙帶菜多肽作為一種混合體系的酶解產(chǎn)物，其抗氧化性可能表現(xiàn)為多重反應機制，因此，本文從O2-·清除能力、·OH清除能力、DPPH自由基清除能力、Fe2+螯合能力4個方面來評價UPPs-L、UPPs-1、UPPs-3、UPPs-5、UPPs-10的抗氧化能力。

2.5.1 不同分子量裙帶菜多肽清除O2-·的能力

圖7 不同分子量段的裙帶菜多肽對O2-·的清除能力Fig.7 O2-·scavenging capacity of UPPS with different molecular weights

由圖7可知，不同分子量段的裙帶菜多肽對O2-·的清除能力不同。其中UPPs-1(Mw=1～3 kDa)對O2-·的清除能力最強，清除率達到31.7%，UPPS-L(Mw<1 kDa)對O2-·的清除能力次之，清除率達到27.5%，UPPs-10(Mw>10 kDa)對O2-·的清除能力最弱，清除率僅達到11.6%。相關(guān)研究報道，酚羥基對O2-·有較強的清除能力，酚羥基的個數(shù)增加會提高O2-·的清除效果[12]。而酪氨酸(Tyr)具有酚羥基結(jié)構(gòu)，能提高多肽的O2-·清除能力。UPPs-1肽段中酪氨酸含量為6.23 g/100 g，遠高于其他組分，在一定程度上提高了UPPs-1的O2-·清除活性。

2.5.2 不同分子量裙帶菜多肽清除·OH的能力

Fe2+可與鄰菲羅啉(phen)生成橙紅色配合物[Fe(phen)3]2+，H2O2在Fe2+的催化下產(chǎn)生具有強氧化性的·OH，使得Fe2+氧化成Fe3+，繼而生成無色或藍色的配合物[Fe(phen)3]3+，原本的溶液褪色。在多肽、氨基酸的存在下，氨基酸等物質(zhì)易與·OH發(fā)生氧化修飾，捕捉·OH，從而延緩溶液的褪色變化，因此可以表征多肽體系的抗氧化性。

圖8 不同分子量段的裙帶菜多肽對·OH的清除能力Fig.8·OH scavenging capacity of UPPS with different molecular weights

由圖8可知，UPPs-L和UPPs-1具有較好的·OH清除效果，清除率分別可以達到21.85%和16.43%，而UPPs-3、UPPs-5、UPPs-10 3個分子量段的裙帶菜多肽的·OH清除能力較弱。

2.5.3 不同分子量裙帶菜多肽清除DPPH自由基的能力

DPPH自由基清除率是快速定量分析多肽作為電子受體、轉(zhuǎn)移電子能力的通用方法[13]。由圖9可知，不同分子量段的裙帶菜多肽對DPPH自由基的清除能力不同，其中低分子量段的UPPs-L、UPPs-1和高分子量段的UPPs-10的清除率較高，分別為58.35%、43.48%和40.29%。中分子量段的UPPs-3和UPPs-5的清除率較低且差別不大，僅為25.62%和22.16%。這是因為高分子量的裙帶菜多肽片段中具有較多電子致密的側(cè)鏈基團，疏水性較強，更易于與DPPH·結(jié)合。而較低分子量片段的裙帶菜多肽自身的空間位阻較小，電子轉(zhuǎn)移能力較好，故而導致了2種分子量的裙帶菜多肽的DPPH自由基清除率較高，這與Bamdad等[14]報道的DPPH自由基的清除率取決于良好的疏水性與在反應介質(zhì)中的良好擴散性相一致。

圖9 不同分子量段的裙帶菜多肽對DPPH自由基的清除能力Fig.9 DPPH·scavenging capacity of UPPS with different molecular weights

2.5.4 不同分子量裙帶菜多肽螯合Fe2+的能力

圖10 不同分子量段的裙帶菜多肽對Fe2+的螯合能力Fig.10 Fe2+ chelating capacity of UPPS with different molecular weights

Fe2+因高效的催化活性，加速自由基的生成，從而引發(fā)氧化性的鏈式反應。由圖10可知，不同分子量片段的裙帶菜多肽對Fe2+的螯合能力明顯不同，其中UPPs-L的Fe2+螯合能力最強，螯合率達89.87%，UPPs-3次之，F(xiàn)e2+的螯合率達82.14%，UPPs-10的Fe2+螯合能力最弱，螯合率僅為47.6%。據(jù)文獻報道，肽段中蘇氨酸、谷氨酸、天冬氨酸的存在，使得肽段容易形成類聚脯氨酸的螺旋結(jié)構(gòu)，提高肽段的金屬螯合能力[15]，這一結(jié)果與UPPs-3氨基酸分析結(jié)果一致，UPPs-3中的蘇氨酸、谷氨酸、天冬氨酸組成含量達25.45%，明顯高于其他組分，因此使得UPPs-3呈現(xiàn)出較高的Fe2+螯合能力。隨著肽段的分子量不斷變小，更多的帶電活性小肽暴露出來，空間位阻減小，更易于與金屬離子發(fā)生化學螯合，從而使得UPPs-L表現(xiàn)出極高的螯合能力。

3 結(jié)論

本研究以多肽的還原能力為指標，通過酶解的單因素和正交試驗確定了堿性蛋白酶為裙帶菜抗氧化肽制備的最佳酶，最優(yōu)酶解條件為：料液比4%、酶解溫度55 ℃、酶解時間3.5 h、加酶量7500 U/g、pH 10.0，此時裙帶菜多肽的還原能力最強，在700 nm處的吸光值為0.411，并對裙帶菜多肽進行超濾分級，從O2-·清除能力、·OH清除能力、DPPH自由基清除能力、Fe2+螯合能力4個方面，探究不同分子量段的裙帶菜多肽的抗氧化能力。結(jié)果表明：裙帶菜多肽在Fe2+螯合能力和DPPH自由基清除能力方面較強，在O2-·清除能力和·OH清除能力方面相對較弱。且總體呈現(xiàn)低分子量的裙帶菜多肽的抗氧化活性較強，高分子量的裙帶菜多肽的抗氧化活性較弱的趨勢。其中，UPPs-L(Mw<1 kDa)的Fe2+螯合能力、DPPH自由基清除能力和·OH清除能力最強，螯合率和清除率分別達到89.87%、58.35%和21.85%，UPPs-1(Mw=1～3 kDa)的O2-·清除能力最強，清除率達到31.7%，UPPs-5(Mw=5～10 kDa)和UPPs-10(Mw>10 kDa)的抗氧化能力均相對較弱。