張飛虎, 于燕子, 張 勝, 李湘洲

(中南林業(yè)科技大學 材料科學與工程學院，長沙 410004)

0 引 言

指紋圖譜分析是一種綜合、定量，基于天然產物化學成分研究基礎上的檢測方法，一般采用高效液相色譜法結合分析軟件進行，指紋圖譜技術已廣泛應用在中藥生產過程控制中[1]，可以有效地解決生產中內在質量控制問題，保證中藥制劑的藥物作用。同時其也大量應用于不同來源物種的鑒別分析。指紋圖譜常見的分析方法有非線性映射[2]、聚類分析[3]、相似性分析[4]、神經網絡[5]和重疊率分析[6]等。

高效液相色譜-質譜聯(lián)用是將高效液相色譜與質譜串聯(lián)而成的儀器。高效液相色譜將樣品中成分分離，質譜提供成分的相對分子量，從而獲得化學成分的信息。高效液相色譜-質譜聯(lián)用整合了高效液相色譜高分離和質譜高鑒別的特點，是天然活性成分研究的重要技術手段[7-8]，在實驗教學中常與指紋圖譜配合使用。

竹是一種重要的非木本森林資源，含有多種活性成分，竹葉提取物的低毒性和其廣泛的藥理活性，吸引了大量研究者的研究興趣[9]。關于竹葉活性成分質量控制的兩個主要方法：一種是用指紋圖譜分析的方法，可提供樣品完整的化學成分信息[10-11]；而另一種是基于特定的活性成分，對其進行分析研究[12-13]。如黃酮(葒草苷、異葒草素、牡荊素和異牡荊)[14]、酚酸(咖啡酸和綠原酸)[15]的含量。

本文將校園中常見6種竹的葉片進行高效液相指紋圖譜分析所獲得的數據進行了比較分析化學成分差異，讓學生掌握指紋圖譜分析在天然活性成分分析中的應用。對于有深入研究興趣的同學，向他們展示運用高效液相色譜-質譜聯(lián)用技術對具有地域特點的長沙青皮竹竹葉的具體成分進行鑒定，讓學生了解高效液相色譜-質譜聯(lián)用技術在天然活性成分研究中的應用。

1 實驗方法

1.1 實驗儀器與材料

指紋圖譜分析的儀器為美國安捷倫公司生產的高效液相色譜儀(型號：Agilent1260)，配有紫外檢測器與四元液相泵；用于液相-質譜分析的儀器為美國應用生物系統(tǒng)公司生產的高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀(型號：API QSTAR Pulsar)，配備四極桿/飛行時間串聯(lián)質譜。實驗用乙腈、甲醇為色譜純，甲酸、磷酸為分析純。實驗用水為超純水。

6種竹葉采自中南林業(yè)科技大學校園內，經中南林業(yè)科技大學林學院陳建華教授鑒定分別為長沙青皮竹(Bambusatextilisvar.persistens. B.M.Yang)；水竹(PhyllostachysheterocladaOliver)；假毛竹(Phyllostachyskwangsiensis)；琴絲竹(Phyllostachysaureosulcata)；斑竹(Phyllostachysbambusoidescv. Lacrima-Deae)；毛竹(Phyllostachysheterocyclacv. Pubescens)。上述竹葉樣品依次編號為S1，S2，S3，S4，S5，S6。

1.2 樣品的制備

竹葉收集后在陰涼處干燥，用植物粉碎機將竹葉粉碎成粗粉。分別稱取粗粉2 g，加甲醇100 mL，回流提取2 h。將提取液濃縮至10 mL，然后用微孔濾膜(0.45 μm)過濾，取濾液進樣。

1.3 指紋圖譜分析條件

反相C18柱(長度與直徑：250 mm×4.6 mm，填料粒度：5 μm)；流動相為0.1%磷酸(A)和乙腈(B)。洗脫條件：初始比例A相為88%，B相為12%；0～30 min之內A相由88%降低至84%，B相由12%升至16%；30～60 min之內A相由84%降低到75%，B相由16%升至25%；60～80 min之內A相由75%降低至40%，B相從25%升至60%。流速：1.0 mL/min，各樣品的進樣量為10 μL，檢測波長330 nm。使用國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件(版本號：2004A)對色譜圖進行分析。

1.4 高效液相色譜-質譜條件

反相C18柱(長度與直徑：100 mm×2 mm，填料粒度：5 μm)；流動相為0.1%甲酸(A)和乙腈(B)。洗脫條件：0 min：90%A，10%B；0～20 min，90%A→70%A，10%B→30%B；20～22 min：70%A→0，30%B→100%B；22～25 min：100%B。流速：0.20 mL/min, 各樣品的注射量為10 μL。波長為330 nm。質譜分析條件：電噴霧離子源，正離子掃描模式，毛細管電壓3.5 kV，噴霧電壓5 500 V，霧化氣壓力0.11 MPa，輔助氣柱前壓68 kPa，干燥溫度450 ℃，干燥氣體流速為8.0 L/min。

2 結果與討論

2.1 指紋圖譜相似性評價

6種竹葉的色譜圖見圖1，共有峰的相對面積和保留時間分別見表1和2，相似性分析結果見表3。

圖1 6種竹葉的色譜圖

由表1可知，6種竹葉色譜圖中有8個共有峰。以最大峰面積的7號峰為對照，峰面積設為1，每個竹葉圖譜中的其他共有峰與之相除得到相對峰面積。表2則提供了8個共有峰出峰的保留時間。由表內數據可知，每個竹葉色譜圖中共有峰的保留時間的標準差(SD)均<1。說明這些峰的選取符合共有峰的特點。指紋譜圖的相似性是一個量化的參數。該參數結合了色譜圖中共有峰的重疊率和峰面積強度。每對樣品色譜圖之間的相似性體現(xiàn)了化學成分的差異性(見表3)。相似性范圍在0～1之間，值為1時表示圖譜是相同的，值為0則表示圖譜完全不同。通過相似性評價系統(tǒng)計算了6種竹葉的色譜指紋圖譜之間的相似性。長沙青皮竹的色譜圖與水竹相似性最大，為0.992，說明兩者化學成分很相似。長沙青皮竹和斑竹色譜圖之間的相似性最小，為0.209，說明兩者化學成分有很大的不同。

表1 共有峰的相對峰面積

表2 共有峰的保留時間 min

表3 竹葉指紋圖譜的相似性分析

2.2 長沙青皮竹化學成分

長沙青皮竹樣品通過高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀獲得色譜的圖見圖2，質譜分析通過相對分子質量可鑒定出8個成分，見表4。成分多為黃酮類，符合竹葉化學成分的一般規(guī)律。

圖2 長沙青皮竹葉液相色譜-質譜分析圖

3 結 語

本實驗通過指紋圖譜分析對不同來源的6種竹類植物葉片化學成分的差異進行了比較，為竹葉的化學成分評價提供了一個新的視角。另外，通過高效液相色譜-質譜技術對具有地域特點的長沙青皮竹中的化學成分進行鑒定分析。

實驗教學是林產化工專業(yè)培養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)。竹葉指紋圖譜分析實驗課共8 學時， 其中4 學時進行高效液相色譜實驗， 另外4 學時進行液相色譜-質譜聯(lián)用儀的講解和操作，指紋圖譜的數據分析由學生在課后進行分析。該實驗主要是色譜分析與質譜分析的應用，同時還涉及了數據統(tǒng)計分析的知識，綜合性與實踐性強， 可全面提升學生的科研能力和實驗操作能力。