新西蘭大白兔佐劑性關節(jié)炎模型的評價

陳芳 劉琴 王麗平 陳利鋒 張宜 楊鴻*

類風濕性關節(jié)炎（RA）是一種慢性自身性免疫性疾病，其病因和發(fā)病機制尚未完全明確，在治療方面亦無特效治療措施[1]。全球有0.5%～1%的人群受到此疾病的影響，該病不僅致殘率高，還可引起血管炎、心包炎等并發(fā)癥，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，造成巨大的家庭和社會負擔[2]。尋找安全、有效緩解RA 病情的藥物是目前治療RA 的重點[3]。佐劑性關節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）動物模型已經(jīng)廣泛用于類風濕性關節(jié)炎發(fā)病機制的研究和評估潛在的抗類風濕性關節(jié)炎藥物的臨床應用[4]。而從報道文獻來看，兔RA 動物模型普遍存在標準不一、流程各異和細節(jié)不清的問題，特別是檢測指標不統(tǒng)一等，甚至只是從肉眼來判斷，諸多設計思路也值得商榷。如何復制出更接近RA 的動物病理模型一直成為困擾風濕免疫科研工作者的難題，因此尋找發(fā)病機制更接近RA 的動物模型具有重要的臨床意義[5]。本研究旨在建立一個較完整的兔佐劑性關節(jié)炎動物模型，為研究關節(jié)疾病的發(fā)病機制、病理變化以及藥物療效、作用機制提供一個實驗平臺。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康新西蘭大白兔16 只，雌雄不限，體質(zhì)量2.5 ～3.0 kg，清潔級，由武漢市新洲區(qū)萬千佳禾實驗動物養(yǎng)殖場提供[SCXK(鄂)2017-0045]，本實驗在廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院醫(yī)學實驗科動物實驗設施內(nèi)進行[SYXK(鄂)2014-0082]。本實驗經(jīng)中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院（中國人民解放軍武漢總醫(yī)院）倫理委員會批準進行[武總動(福)第2018038 號]。

1.2 實驗試劑及儀器

弗式完全佐劑（Sigma 公司，美國）；蘇木素、伊紅Y（水溶性）、無水乙醇、二甲苯、鹽酸、包埋石蠟、中性樹脂等由國藥集團提供；脫鈣液（硝酸-甲醛液，按甲醛15 mL，蒸餾水90 mL，純硝酸20 mL 比例來配制），硝酸和甲醛由武漢市潔洋盛科技公司提供；病理切片機（Leica RM2016輪轉(zhuǎn)式切片機，德國），組織攤烤片機（武漢俊杰JK-6 生物組織攤烤片機），顯微鏡（尼康E100 型生物顯微鏡），倒置熒光顯微鏡（奧林巴斯，日本），軟皮尺等。

1.3 實驗方法

1.3.1 AA 兔模型的建立[6]

新西蘭兔16 只，1 只/籠進行分籠喂養(yǎng)，隨機分組為正常組（8 只）和模型組（8 只），飼養(yǎng)間溫度18 ～24℃，相對濕度40%～60%。新西蘭兔適應性喂養(yǎng)1 周后，足爪剃毛稱體重，測足趾部的周徑。模型組初次誘導：將家兔背部肩胛骨間及雙膝關節(jié)以下的毛用脫毛劑脫去，每只新西蘭兔右跖部皮下注射弗氏完全佐劑0.4 mL，同時注射背部4 點，每點0.2 mL。加強誘導：注射后7 d 加強注射弗式完全佐劑1 次，每只新西蘭兔右跖部皮下注射弗氏完全佐劑0.4 mL；背部任意2 點，每點注射0.2 mL。

1.3.2 AA 兔模型的鑒定

1.3.2.1 雙側(cè)足趾周徑測定

采用軟皮尺于造模前、造模后24 d 分別測定各組家兔雙足跖周徑變化。測量時注意取相同松緊度，于足趾腫脹最高點進行測量。

1.3.2.2 兔雙足X 線片變化

隨機抽取正常組和模型組兔各3 只，于我院放射科行雙足斜位X 線片。并對其足趾軟組織腫脹度、關節(jié)變化情況進行評價。

1.3.2.3 滑膜組織HE 染色

在取材之前對兔肉眼所見拍照，并在取材過程中拍下一些典型的病變特征。實驗動物脫臼處死，取踝關節(jié)，修剪整齊后，放入10%的甲醛固定液中，固定1 周后，轉(zhuǎn)入甲酸脫鈣液中，脫鈣至骨質(zhì)變軟，用小刀切取軟骨，修剪成0.5 cm×0.4 cm×0.3 cm，并包埋（梯度乙醇脫水、二甲苯脫水、透明，石蠟包埋切片，分別用蘇木精-伊紅染色）。

1.4 統(tǒng)計學方法

用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 AA 兔足趾周長的影響

表1 結(jié)果顯示，造模前，各組間右足趾周長差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），造模各組右足趾周長差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性；造模組足趾周長均較正常組明顯升高（P＜0.05）。

表1 各組實驗兔致炎側(cè)足趾周長比較

表1 各組實驗兔致炎側(cè)足趾周長比較

注：*與正常組比較＜0.05。

組別 n(只） 致炎側(cè)足趾周長（cm）造模前 造模后正常組 8 5.98±0.14 6.08±0.08模型組 8 5.92±0.12 7.96±0.45*

2.2 AA 兔X 線片表現(xiàn)的影響

X 線片結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組AA 兔軟組織腫脹明顯，關節(jié)間隙變窄甚則模糊，骨皮質(zhì)變?。ㄒ妶D1）。

圖1 各組實驗兔雙足X 線片：A.正常組；B.模型組

2.3 AA 兔足關節(jié)外部觀察及HE 染色結(jié)果

新西蘭兔造模24 d 后，外部觀察足關節(jié)及足趾部明顯腫脹變形（見圖2A、圖2B），解剖可見踝關節(jié)腔有明顯的積液（見圖2C、圖2D）,解剖可見模型兔足趾部有明顯微血管增生和炎癥（見圖2E、圖2F）；滑膜組織切片HE 染色顯示，正常組的滑膜細胞呈現(xiàn)“串珠樣”規(guī)則排列（見圖3A），而模型組的滑膜細胞排列紊亂，而且還出現(xiàn)細胞水腫現(xiàn)象（見圖3B），模型組的滑膜層出現(xiàn)大量的炎性細胞和多核巨噬細胞（見圖3D）而正常組無炎性細胞（見圖3C），提示AA 兔模型制備成功。

圖2 新西蘭兔的足爪、關節(jié)腔及足關節(jié)的病變特征：A.正常組足；B.模型組足；C.正常組足關節(jié)；D.模型組足關節(jié)；E.正常組爪解剖面；F.模型組爪解剖面

圖3 新西蘭兔足關節(jié)滑膜組織HE 染色：A.正常組滑膜組織HE 染色呈現(xiàn)“串珠樣”規(guī)則排列（×200）；B.模型組滑膜組織HE染色出現(xiàn)細胞水腫現(xiàn)象（×200）；C.正常組滑膜組織HE 染色無炎性細胞（×200）；D.模型組滑膜組織HE 染色，滑膜層出現(xiàn)大量的炎性細胞和多核巨噬細胞（×200）

3 討論

雖然目前對RA 的研究已經(jīng)深入到細胞水平、分子水平以及基因水平，但RA 的病因和發(fā)病機制極其復雜，為醫(yī)學上仍未解決的難題[7]。其臨床表現(xiàn)為對稱性的多關節(jié)腫脹、疼痛，最終可造成關節(jié)結(jié)構(gòu)破壞、功能障礙，甚至致殘[8]。據(jù)臨床觀察，RA 的主要病理特征為：關節(jié)滑膜炎，滑膜組織增生以及對骨和軟骨的結(jié)構(gòu)性損傷。RA 的病理過程主要是關節(jié)炎癥細胞及浸潤和滑膜細胞增殖和侵襲，形成侵襲性血管翳，導致骨和軟骨破壞[9]。動物模型是研究RA 的發(fā)病機制和藥效學的重要手段之一。常用于制備模型的動物主要是大鼠，其次是兔，但是由于小動物在生理學和免疫學方面與人類有很大的不同，相比大鼠關節(jié)炎模型，弗氏完全佐劑（complete Freund's adjuvan，CFA）誘導的兔關節(jié)炎模型在病理變化方面更接近人[10-11]，這就使得探索建立大動物模型變得尤為必要。AA 兔模型又稱弗氏佐劑關節(jié)炎兔模型，是一種使用廣泛的風濕性關節(jié)炎動物模型，可用于預測多種藥物對RA 的臨床療效。早期動物的炎癥反應的部位常出現(xiàn)在四肢并不斷加重，活動不便，尾部潰爛，出現(xiàn)類風濕結(jié)節(jié)，體重下降，特別是繼發(fā)性自身免疫性腫脹，這些表現(xiàn)與人的RA 表現(xiàn)相似。AA 兔模型是RA 的經(jīng)典模型，已較為成熟，與人的病理過程十分的相似。本研究中將兔作為研究對象，采用多次多點于新西蘭兔右跖部皮下注射CFA 誘導AA 兔模型，造模3 周后，外部觀察足關節(jié)及足趾部明顯腫脹，嚴重致跛行，解剖可見模型兔足趾部有明顯微血管增生和炎癥，滑膜組織切片HE 染色顯示，正常組的滑膜細胞呈現(xiàn)“串珠樣”規(guī)則排列，而模型組的滑膜細胞排列紊亂并出現(xiàn)水腫，這些表現(xiàn)與類風濕性關節(jié)炎相符。

成功的AA 動物模型除了在病理學上與臨床一致，同時需要具備操作簡單、可重復性等特點，并且用于造模的實驗動物、試劑易購買等[12]。本研究旨在尋求一種較為穩(wěn)定的AA 兔模型制作體系，只有規(guī)范了動物模型，后續(xù)的實驗研究才具有科學性。因此筆者在實驗過程中體會到AA 兔模型的規(guī)范化需要做大量工作。一是實驗動物質(zhì)量和倫理的程序化要求。應重視實驗動物質(zhì)量合格證號及單位倫理審核號。二是實驗設計的科學性要求。皮下注射CFA 的量及時間都應慎重，在前期的預實驗過程中發(fā)現(xiàn)CFA 的量少，造模不成功，量多導致兔狀態(tài)極差，影響后續(xù)實驗的開展，發(fā)現(xiàn)皮下注射CFA 后，前1 周有一個急性期，而加強1 周后趨于穩(wěn)定。脫鈣是骨組織制片中的重要步驟，也是病理技術難點，而脫鈣劑的選擇十分重要。關節(jié)結(jié)構(gòu)既包含致密的骨組織，又包含周圍的肌肉、韌帶等軟組織，因此對其病理制片前期處理的要求更高，即要充分脫鈣又不能損傷軟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)[13-14]。在取材脫鈣的過程中，脫鈣液的配制以及脫鈣時間也需要去探索，室溫越高作用效果越明顯，也就是夏天的脫鈣效果比冬天脫鈣效果好，否則脫鈣不完全或脫鈣太過，會對切片造成影響。三是有效性指標的要求。在實驗中評價一個模型的建立是否成功，應該由病理特征為依據(jù)，而不是通過肉眼觀察，前期實驗過程中，很容易被急性期迷惑。病理特征為依據(jù)應當與臨床類風濕性關節(jié)炎的病變特征相結(jié)合來考慮，這樣建立的模型才能更好地為臨床中西藥研究服務。