刁翠茹，韓建強(qiáng)，張玉榮，張栓波，李祥，王浩，*

（1.食品營養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2.河北玉橋食品有限公司，河北 石家莊 051500）

面條起源于我國漢代，至今已有4 000 多年的制作和食用歷史[1]。河北發(fā)酵宮面，始于唐，興于清，需要經(jīng)過20 h 自然發(fā)酵，16 道工藝加工而成，發(fā)酵后的面條易于消化吸收，散發(fā)酵面香氣，為河北傳統(tǒng)非遺食品。宮面發(fā)酵過程中，面團(tuán)內(nèi)自然產(chǎn)生的一些有益菌，形成特殊風(fēng)味和組織結(jié)構(gòu)，因而比普通掛面更受歡迎。

面團(tuán)的微生物菌群結(jié)構(gòu)是影響面條品質(zhì)的一個(gè)重要因素之一，同時(shí)也是發(fā)酵宮面特征形成的主要影響因素。目前國內(nèi)已有研究對發(fā)酵饅頭、面包等面團(tuán)微生物進(jìn)行了部分分析，但是對發(fā)酵宮面的研究還較少，本文利用16S rDNA V4 區(qū)和18S rDNA V4 區(qū)對宮面面團(tuán)進(jìn)行分析，對傳統(tǒng)自然發(fā)酵面團(tuán)中微生物菌群組成進(jìn)行快速、深入的探索，同時(shí)對乳酸菌和酵母菌進(jìn)行菌落分離鑒定，以期為實(shí)現(xiàn)發(fā)酵宮面的工業(yè)化生產(chǎn)提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵宮面面團(tuán)樣品：河北省石家莊市玉橋食品廠；MRS 培養(yǎng)基：青島高科技園海博生物技術(shù)有限公司；脫脂乳培養(yǎng)基及YPD 固體培養(yǎng)基：天津科技大學(xué)食品營養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室配制。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004N 電子分析天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；DY04-13-44-00 高壓蒸汽滅菌鍋：（山海東亞壓力容器制造有限公司；SW-CJ-1FD 無菌操作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；YQX-Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；DM750 電子顯微鏡：Leica。

1.3 方法

1.3.1 宮面面團(tuán)宏基因組測序

以細(xì)菌基因組DNA 作為模板，采用16S rDNA 擴(kuò)增子測序技術(shù)以16S rDNA V4 區(qū)分析宮面樣品中的細(xì)菌組成。以真菌基因組DNA 作為模板，采用18S rDNA擴(kuò)增子測序技術(shù)以18S rDNA V4 區(qū)分析樣品中的真菌組成。測序工作由諾禾致源公司完成。

1.3.2 宮面面團(tuán)微生物的培養(yǎng)與分離

準(zhǔn)確稱取面團(tuán)10.0 g，于90.0 mL 無菌生理鹽水中振蕩，并對菌懸液進(jìn)行梯度稀釋。分別吸取各稀釋度菌液100 μL 于MRS 固體培養(yǎng)基和YPD 固體培養(yǎng)基進(jìn)行平板涂布；MRS 固體培養(yǎng)基置于37℃厭氧培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)48 h，YPD 固體培養(yǎng)基置于28℃恒溫培養(yǎng)72 h，觀察菌落生長情況。將上述培養(yǎng)的乳酸菌進(jìn)行平板劃線分離，分離出單菌落，進(jìn)行革蘭氏染色，并顯微鏡觀察形態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵面團(tuán)中細(xì)菌分析

16S rDNA 擴(kuò)增子測序，16S rDNA 擴(kuò)增子測序技術(shù)已成為研究環(huán)境樣品中微生物群落組成結(jié)構(gòu)的重要手段通常是選擇某個(gè)或某幾個(gè)變異區(qū)域，利用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，然后對高變區(qū)進(jìn)行測序分析和菌種鑒定[2-4]，門水平上微生物物種的相對豐度見圖1。

圖1 門水平上微生物物種的相對豐度Fig.1 Relative abundance of microbial species at phylum level

發(fā)酵面團(tuán)樣品經(jīng)宏基因組16S rDNA V4 區(qū)分析，宮面面團(tuán)中的微生物主要是變形菌門（Proteobacteria）和藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria），而厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria）則占很小的比例。藍(lán)細(xì)菌門含有葉綠素β-胡蘿卜素等，普遍分布在土壤和淡水中。其他四大菌門與腸道微生物群相似，厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）占微生物群的90 %以上，其次是放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）[5]。

16S rDNA 測序得到屬于厚壁菌門（Firmicutes）乳桿菌目的乳酸菌種類見表1。

表1 乳酸菌種類Table 1 Types of lactic acid bacteria

由表1可知，5個(gè)不同科分別是：乳桿菌科（Lactobacillaceae）、鏈球菌科（Streptococcaceae）、明串珠菌科（Leuconostocaceae）、肉桿菌科（Carnobacteriaceae）和氣球菌科（Aerococcaceae）。6個(gè)不同的屬分別是：魏氏菌屬（Weissella）、乳酸菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、氣球菌屬（Aerococcus）和 Marinilactibacillus。7個(gè)不同種，它們分別是魏氏菌（Weissella）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、棉子糖乳球菌（Lactococcus raffinolactis）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、草綠色氣球菌（Aerococcus viridans）、Marinilactibacillus psychrotolerans，其中優(yōu)勢菌屬是發(fā)酵乳桿菌和魏氏菌，占乳酸菌的88.5%。另外，檢測到放線菌門（Actinobactteria）下雙歧桿菌目的雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）1 株。綜合已有文獻(xiàn)，發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）是3 株典型的益生菌。

在我國，不同地區(qū)的發(fā)酵面團(tuán)細(xì)菌組成差別很大[6]：華中地區(qū)（如河南?。⑷A北地區(qū)（如山西?。┖臀鞅钡貐^(qū)（如甘肅?。﹥?yōu)勢菌為乳桿菌（Lactobacillus），次優(yōu)勢菌為明串珠菌屬（Leuconostoc）；華東地區(qū)（如安徽省）：優(yōu)勢菌為明串珠菌屬（Leuconostoc），次優(yōu)勢菌為乳球菌（Lactococcus）；東北地區(qū)（如黑龍江?。﹥?yōu)勢菌為乳桿菌（Lactobacillus），次優(yōu)勢菌為魏斯氏菌（Weissella）。在發(fā)酵面團(tuán)中含有的有益菌多數(shù)為酵母菌和乳酸菌。目前，從酸面團(tuán)分離出的乳酸菌大多數(shù)屬于乳桿菌（Lactobacillus），還包括明串株菌（Leuconostoc）、魏斯氏菌（Weissella）、片球菌（Pediococois）、乳球菌（Lactococcus）和鏈球菌（Streptococcus）屬的乳酸菌[7]。吳斯日古冷[8]應(yīng)用16S rDNA 技術(shù)測定了內(nèi)蒙古西部地區(qū)的28 份酸面團(tuán)樣品中的乳酸菌組成，鑒定出37 株植物乳桿菌（L.plantarum）、7 株融合魏斯氏菌（W.confusa）、3 株乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactis subsp.lactis）和1 株發(fā)酵乳桿菌（L.fermentum）等。趙烜影等[9]通過應(yīng)用16S rDNA V3 區(qū)測序分析了自然發(fā)酵黏豆包面團(tuán)微生物菌群結(jié)構(gòu)，鑒定出面團(tuán)樣品中細(xì)菌組成主要為：食竇魏斯氏（Weissella cibaria）、融合魏斯氏菌（Weissella confuse）、腸系膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）和羅氏乳桿（Lactobacillus reuteri）等。張楚楚[10]對自然發(fā)酵面團(tuán)中的細(xì)菌群落進(jìn)行研究，通過16S 測序、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳技術(shù)（polymerase chain reac tion-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）和傳統(tǒng)分離鑒定手段，發(fā)現(xiàn)面團(tuán)中的細(xì)菌主要為乳桿菌屬、片球菌屬和魏斯氏菌屬，并測得在種水平上的發(fā)酵乳桿菌占總?cè)闂U菌目的14%。

2.2 發(fā)酵面團(tuán)中酵母菌分析

傳統(tǒng)的真菌分類鑒定主要是按照真菌的形態(tài)、生長以及生理生化等特征對真菌進(jìn)行分類。采用傳統(tǒng)的方法對真菌進(jìn)行正確的分類存在較大的困難。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，核酸序列分析已被廣泛的應(yīng)用于真菌分類鑒定中，目前常用的技術(shù)為18S rDNA 測序[11-13]。發(fā)酵面團(tuán)樣品經(jīng)宏基因組18S rDNA V4 區(qū)測定發(fā)現(xiàn)屬于真菌界酵母菌綱下的畢赤酵母科（Pichiaceae）、梅奇酵母科（Metschnikowiaceae）和 2個(gè)未分類的酵母科。檢測到3種水平的酵母，即異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）、熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）和東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）。檢測結(jié)果顯示異常威克漢姆酵母是真菌中的優(yōu)勢菌。具體菌群物種分類見圖2。

圖2 酵母菌菌種分類Fig.2 Classification of yeast strains

目前從面團(tuán)中分理出來的酵母菌種類很少，主要是酵母菌屬和假絲酵母屬[14-15]，另外少孢酵母（Saccharomyces exiguus），東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis），畢赤酵母（Pichia anomaia）和霍氏假絲酵母（Candida holmii）等。目前研究發(fā)現(xiàn)，酸面團(tuán)中大約含有20種酵母菌，其中包括最廣泛的釀酒酵母（S.cerevisiae），以及S.exiquus、小假絲酵母（C.humilis）和東方伊薩酵母（I.orientalis）[16]。宮面面團(tuán)經(jīng)測序檢測到含有伊薩酵母屬（Issatchenki）、Wickerhamomycess 和假絲酵母屬（Candida）。吳斯日古冷[8]采用26S rDNA 序列分析法從酸面團(tuán)樣品中分離出：釀酒酵母（S.cerevisiae）、小假絲酵母（C.humilis）、異常畢赤酵母（P.anomala）、海洋酵母（K.exigua）、畢赤酵母（P.kudriavzevii）和近平滑假絲酵母（C.parapsilosis）等。

Sofia 等[17]在坦桑尼亞一種名為togwa 的玉米粥中發(fā)現(xiàn)了東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）、畢赤酵母（Pichia anomaia）和假絲酵母（Candida glabrata）等，研究發(fā)現(xiàn)，這幾種酵母對togwa 粥的感官品質(zhì)有一定貢獻(xiàn)。Martin 等[18]對烏干達(dá)的一種粥中的微生物進(jìn)行分離，研究發(fā)現(xiàn)有多種優(yōu)勢菌發(fā)揮作用，該微生物體系中包括東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis），此酵母分別對該粥的發(fā)酵及成熟起到重要作用。劉婷婷[19]在白云邊酒的發(fā)酵堆積料和出池酒醅中分離鑒定出東方伊薩酵母，檢測出有 4 株，分別為 Z1、Z2、Z3、FJ5。同時(shí)，在西班牙的紅葡萄中分離鑒定出具有產(chǎn)酯能力的東方伊薩酵母，此菌株對葡萄酒發(fā)酵起到一定的作用[20]。

異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）又稱異常畢赤酵母（Pichia anomala）或異常漢遜酵母（Hansenula anomala），Daniel 等研究發(fā)現(xiàn)，該種酵母在比利時(shí)的手工烘培食品中最常見[21]。劉建利等采用高通量測序技術(shù)對我國不同地區(qū)的面引子樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示釀酒酵母和異常威克漢姆酵母為面引子中的優(yōu)勢菌群[22]。馬榕燦等研究了釀酒酵母與異常威克漢姆酵母對面團(tuán)發(fā)酵特性的影響，結(jié)果顯示，異常威克漢姆酵母發(fā)酵面團(tuán)產(chǎn)氣緩慢同時(shí)持續(xù)時(shí)間長，且發(fā)酵面團(tuán)中存在較多的還原糖，更有利于面團(tuán)發(fā)酵[23]。

在發(fā)酵宮面面團(tuán)中，本研究檢測到東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）和異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus），推測其對宮面面團(tuán)的發(fā)酵品質(zhì)特性有一定的貢獻(xiàn)。

2.3 乳酸菌分離及鑒定

乳酸菌經(jīng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，分離得單菌落。經(jīng)革蘭氏染色分析，在40 倍顯微鏡下觀察染色結(jié)果為紫色，證明面團(tuán)中的乳酸菌為革蘭氏陽性菌，同時(shí)觀察到平板上分別有桿菌和球菌。乳酸菌平板劃線分離和革蘭氏染色結(jié)果見圖3。

圖3 乳酸菌平板劃線分離和革蘭氏染色Fig.3 Lactobacillus planar lineation separation and gram staining

采用一代測序技術(shù)鑒定平板劃線分離得到的單菌，經(jīng)檢測確定為為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）。

2.4 酵母菌分離及鑒定

酵母菌經(jīng)YPD 培養(yǎng)基，分離得到單菌落。酵母菌培養(yǎng)和平板劃線分離結(jié)果見圖4。

圖4 酵母菌培養(yǎng)和平板劃線分離Fig.4 Yeast culture and plate separation

經(jīng)26S rDNA 測序，并進(jìn)行基因序列比較證明，酵母菌為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）和東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）。

3 結(jié)論

本研究對河北玉橋發(fā)酵宮面面團(tuán)微生物菌群組成進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)該面團(tuán)中的優(yōu)勢菌群與華北地區(qū)面團(tuán)中的優(yōu)勢菌群很相似。宮面面團(tuán)中細(xì)菌菌群比酵母菌群種類更多，所占微生物體系的比例更大，其中乳酸菌屬Lactobacillus 和魏氏菌屬Weissella 是細(xì)菌菌群的優(yōu)勢菌屬；酵母菌群中異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）和東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）為優(yōu)勢菌群。在以后的生產(chǎn)中，可以通過純培養(yǎng)從發(fā)酵宮面面團(tuán)中獲得相關(guān)有益菌株，以尋找發(fā)酵宮面的功能菌，為宮面品質(zhì)的改善提供支持。