HPLC-DAD-ESI-TOF／MS 法分析安神補(bǔ)腦液中化學(xué)成分

程素盼， 張敏敏， 梁 琰， 張貴民， 蘇瑞強(qiáng)， 耿巖玲， 王 曉?， 趙恒強(qiáng)?

[1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 山東 濟(jì)南250355； 2. 齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）， 山東省分析測(cè)試中心， 山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山東 濟(jì)南250014； 3. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安271018； 4. 魯南制藥集團(tuán)股份有限公司， 中藥制藥共性技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山東省中藥制藥新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山東 臨沂276006］

安神補(bǔ)腦液由淫羊藿、 制何首烏、 鹿茸、 干姜、 甘草、 大棗、 維生素B1 通過現(xiàn)代工藝精制而成， 具有安神健腦、 生精補(bǔ)髓、 益氣養(yǎng)血的功效，臨床上常用于治療腎精不足、 氣血兩虧所致頭暈、乏力、 健忘、 失眠、 神經(jīng)衰弱等癥狀[1-3］， 2015 版《中國藥典》 一部采用HPLC 法測(cè)定淫羊藿中淫羊藿苷、 西藥維生素B1 的含有量來對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制[3］， 也有一些報(bào)道采用相同方法測(cè)定其中1、 2種成分的含有量[4-9］。 但安神補(bǔ)腦液為中藥復(fù)方制劑， 是通過多味中藥中活性成分的協(xié)同作用來發(fā)揮藥效， 上述方法并不能全面反映其整體質(zhì)量。

近年來， 色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)發(fā)展迅速， 因其分離度好、 靈敏度高、 分析周期短等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于中藥復(fù)方制劑的檢測(cè)分析， 特別是高分辨飛行時(shí)間（TOF／MS） 質(zhì)譜技術(shù)能給出化合物的精確分子量信息， 從而進(jìn)一步推斷出分子式， 可在沒有對(duì)照品的情況下結(jié)合參考文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫等進(jìn)行初步鑒別[10］。 因此， 本實(shí)驗(yàn)建立高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器-電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜（HPLC-DAD-ESITOF／MS） 法[11-14］分析安神補(bǔ)腦液中化學(xué)成分。

1 材料

1.1 儀器 華譜S6000 高效液相色譜儀， 配置自動(dòng)進(jìn)樣器、 四元泵、 柱溫箱、 二極管陣列檢測(cè)器；Agilent 6520 Q-TOF 液質(zhì)聯(lián)用儀 （美國Agilent Technologies 公司）； 電子分析天平（十萬分之一，德國Sartourius 公司）； SB-5200D 高功率數(shù)控超聲波儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試藥 維生素B1 （批號(hào)SLBG9 093 V）、 甘草苷（批號(hào)P25J7F18328）、 2， 3， 5， 4′-四羥基二苯乙烯葡萄糖苷（批號(hào)P25D5S1）、 淫羊藿苷（ 批 號(hào) T09N6B5664 ）、 大 黃 素 （ 批 號(hào)P19A7F13264） 對(duì)照品（含有量大于98%， 上海源葉生物科技有限公司）； 次黃嘌呤 （批號(hào)F20100102） 對(duì)照品（含有量大于98%， 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）； 甘草酸、 6-姜辣素（自制，含有量大于98%）。 安神補(bǔ)腦液（魯南厚普有限公司生產(chǎn)） 于2016 年購自濟(jì)南市各大藥店， 批號(hào)07115003、 00816047、 00815055、 00816028、07115006、 07115019、 00816002、 00816123、00816103、 00816058， 編號(hào)S1 ～S10。 乙腈為色譜純（美國Fisher Scientific 公司）； 甲醇為色譜純（山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司）； 甲酸為色譜純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）； 無水乙醇為分析純（天津市廣成化學(xué)試劑有限公司）； 水為密理博超純水（18 MΩ）。

2 方法與結(jié)果

2.1 成分分析

2.1.1 供試品溶液制備 取適量安神補(bǔ)腦液（編號(hào)S1） 搖勻， 過0.22 μm 微孔濾膜， 即得。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取維生素B1、 次黃嘌呤、 甘草苷、 二苯乙烯苷、 淫羊藿苷、 甘草酸、 6-姜辣素、 大黃素對(duì)照品各1.0 mg， 置于1 mL量瓶中， 甲醇定容至刻度， 配成1 mg／mL 貯備液，各精密吸取適量于2 mL 量瓶中， 甲醇定容至刻度，制成含500 μg／mL 維生素B1、 100 μg／mL次黃嘌呤、 200 μg／mL 甘草苷、 200 μg／mL 二苯乙烯苷、300 μg／mL 淫 羊 藿 苷、 100 μg／mL 甘 草 酸、100 μg／mL 6-姜辣素、 100 μg／mL 大黃素的溶液，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液制備 按處方比例及2015 版《中國藥典》 一部規(guī)定的工藝， 分別制備缺維生素B1、 淫羊藿、 制何首烏、 鹿茸、 甘草、 干姜的陰性樣品， 按“2.1.1” 項(xiàng)下方法制備， 即得。

2.1.4 色譜條件 Waters XELECTTM HSS T3 色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）； 流動(dòng)相乙腈（A） -0.4%甲酸 （B）， 梯度洗脫， 程序見表1； 柱溫25 ℃； 檢測(cè)波長278 nm； 進(jìn)樣量10 μL。 色譜圖見圖1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.5 質(zhì)譜條件 流動(dòng)相采用三通分流至0.4 mL／min； 電噴霧正、 負(fù)離子模式； 全掃描范圍m／z 100～1 000； 毛細(xì)管電壓4.0 kV； 噴霧氣壓310.28 kPa； 干燥氣體積流量10.0 L／min， 溫度325 ℃； 裂解電壓100 V； 錐孔電壓60 V。

2.1.6 ESI-TOF／MS 鑒別 采用ESI-TOF／MS 技術(shù)對(duì)各成分色譜峰峰進(jìn)行鑒別， 根據(jù)其精確分子量信息、 DAD 檢測(cè)器所得紫外吸收信息、 前期相關(guān)文獻(xiàn)、 中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫來進(jìn)行鑒別， 推斷出可能的分子式， 并與相應(yīng)對(duì)照品進(jìn)行比較以保證準(zhǔn)確性。 結(jié)果見表2。

2.2 含有量測(cè)定

2.2.1 線性關(guān)系考察 將“2.1.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液稀釋成不同質(zhì)量濃度， 在“2.1.4” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。 以成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸， 然后將溶液稀釋至低質(zhì)量濃度， 以3 倍信噪比為檢出限， 10 倍信噪比為定量限， 結(jié)果見表3， 可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2 精密度試驗(yàn) 取供試品溶液（編號(hào)S1），在“2.1.4” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次， 測(cè)得維生素B1、 次黃嘌呤、 甘草苷、 二苯乙烯苷、 淫羊藿苷、 甘草酸、 6-姜辣素、 大黃素保留時(shí)間RSD分別為0.32%、 0.14%、 0.29%、 0.31%、 0.20%、0.09%、 0.09%、 0.06%， 峰 面 積 RSD 分 別 為1.05%、 1.90%、 3.50%、 2.31%、 1.29%、 4.71%、1.84%、 3.92%， 表明儀器精密度良好。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品（編號(hào)S1） 6 份， 按“2.1.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.1.4” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 測(cè)得維生素B1、 次黃嘌呤、 甘草苷、 二苯乙烯苷、 淫羊藿苷、 甘草酸、 6-姜辣素、大黃素保留時(shí)間RSD 分別為0.33%、 0.24%、 0.45%、0.46%、 0.27%、 0.14%、 0.12%、 0.12%， 峰面積RSD分 別 為 1.89%、 2.56%、 3.38%、 2.87%、 3.90%、4.52%、 2.08%、 2.72%， 表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液（編號(hào)S1），在“2.1.4” 項(xiàng)色譜條件下于0、 4、 8、 16、 24 h進(jìn)樣測(cè)定， 測(cè)得維生素B1、 次黃嘌呤、 甘草苷、二苯乙烯苷、 淫羊藿苷、 甘草酸、 6-姜辣素、 大黃素保留時(shí)間RSD 分別為0.32%、 0.81%、 0.31%、0.38%、 0.14%、 0.09%、 0.12%， 0.65%， 峰 面積RSD 分別為3.21%、 2.72%、 3.54%、 2.10%、3.76%、 4.52%、 4.06%、 2.72%， 表 明 溶 液 在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表2 各成分ESI-TOF／MS 鑒別結(jié)果Tab.2 Results of ESI-TOF／MS identification of various constituents

表3 各成分線性關(guān)系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.2.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取含有量已知的樣品（編號(hào)S1） 1 mL， 共6 份， 精密加入各對(duì)照品適量， 按“2.1.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.4” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 測(cè)得維生素B1、 次黃嘌呤、 甘草苷、 二苯乙烯苷、 淫羊藿苷、甘草酸、 6-姜辣素、 大黃素平均加樣回收率分別為96.50%、 94.29%、 95.94%、 97.48%、 91.10%、 95.27%、91.47%、 107.50%， RSD 分 別 為 2.78%、 6.36%、6.64%、 2.43%、 3.91%、 5.01%、 4.60%、 4.91%。

2.2.6 樣品含有量測(cè)定 按“2.1.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.1.4” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 計(jì)算含有量， 結(jié)果見表4。

表4 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（μg／mL）Tab.4 Results of content determination of various constituents （μg／mL）

3 討論

3.1 指標(biāo)成分選擇 安神補(bǔ)腦液為《金匱要略》收載的養(yǎng)心安神名方甘麥大棗湯的加減方[6］， 方中制何首烏補(bǔ)肝腎， 益精血， 起養(yǎng)心安神之效[15］；鹿茸富含磷脂、 氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)， 在消除疲勞、增強(qiáng)免疫力的同時(shí)可改善睡眠質(zhì)量[16］； 淫羊藿具有補(bǔ)腎壯陽、 強(qiáng)筋健骨功效[16］； 干姜溫中散寒，具有養(yǎng)心、 延長睡眠時(shí)間的作用[17］； 甘草調(diào)和諸藥。 2015 年版《中國藥典》 中制何首烏、 淫羊藿、干姜、 甘草含有量測(cè)定指標(biāo)分別為二苯乙烯苷和蒽醌（大黃素）、 淫羊藿苷、 6-姜辣素、 甘草苷和甘草酸， 而且維生素B1 具有維持神經(jīng)正常的功能，《中國藥典》 也將其列入[3］， 同時(shí)次黃嘌呤也是鹿茸抑制單胺氧化酶的有效成分[18］。 最終， 選擇以上8 種成分作為安神補(bǔ)腦液含有量測(cè)定的指標(biāo)成分。

3.2 色譜柱選擇 本實(shí)驗(yàn)比較了Agilent XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、 Waters XELECTTM HSS T3 （3.0 mm×150 mm， 3.5 μm） 色譜柱， 發(fā)現(xiàn)后者對(duì)安神補(bǔ)腦液中各成分的分離效果較好。

3.3 流動(dòng)相選擇 本實(shí)驗(yàn)比較了甲醇-水、 乙腈-水流動(dòng)相， 發(fā)現(xiàn)后者分離效果較好， 而且峰數(shù)多，基線平穩(wěn)， 同時(shí)由于安神補(bǔ)腦液所含成分比較復(fù)雜， 等度洗脫難以進(jìn)行有效分離， 故采用梯度洗脫。 然后， 本實(shí)驗(yàn)又向流動(dòng)相中加入不同體積分?jǐn)?shù)（0.2%、 0.3%、 0.4%、 0.6%） 甲酸， 發(fā)現(xiàn)0.4%甲酸能較好地改善拖尾現(xiàn)象， 并且峰形尖銳。

3.4 柱溫、 體積流量選擇 本實(shí)驗(yàn)調(diào)節(jié)柱溫20、25、 35 ℃， 發(fā)現(xiàn)25 ℃下各成分色譜峰分離度和峰形較好。 安神補(bǔ)腦液中維生素B1 極性很大， 出峰時(shí)間過快， 受其他極性成分的影響較明顯， 文獻(xiàn)[9］ 報(bào)道， 流動(dòng)相中加入鹽可延緩該成分出峰時(shí)間， 而本實(shí)驗(yàn)采用初始低體積流量的方法也實(shí)現(xiàn)了較好分離， 并且操作簡便易行。

3.5 檢測(cè)波長選擇 本實(shí)驗(yàn)通過紫外檢測(cè)器對(duì)樣品進(jìn)行全波長（190～400 nm） 掃描， 發(fā)現(xiàn)278 nm處各成分色譜峰峰形良好， 基線穩(wěn)定。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立HPLC-DAD-ESI-TOF／MS 法分析安神補(bǔ)腦液中化學(xué)成分， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)40 種， 并鑒定出其中20 種， 然后測(cè)定維生素B1、 次黃嘌呤、 甘草苷、 二苯乙烯苷、 淫羊藿苷、 甘草酸、 6-姜辣素、大黃素含有量， 可為該制劑藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量評(píng)價(jià)研究提供方法學(xué)支持。