逍遙散對(duì)脂多糖誘導(dǎo)抑郁樣行為的影響

石博宇， 葉曉林， 羅 杰， 劉小波， 彭 希， 劉 蓉， 曾 南

（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地， 四川 成都 611137）

抑郁癥是一種臨床常見的精神障礙性疾病， 以持續(xù)性情緒淡漠、 悲觀等為主要臨床特征， 大量研究表明炎癥反應(yīng)與其病理生理機(jī)制密切相關(guān)。 逍遙散始載于宋代《太平惠民和劑局方》， 是中醫(yī)調(diào)治情志活動(dòng)異常的經(jīng)典名方， 具有疏肝解郁、 養(yǎng)血健脾之功效， 主治肝郁血虛脾弱諸證； 現(xiàn)代藥理研究顯示， 它具有抗抑郁、 調(diào)節(jié)中樞單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平、 調(diào)控體內(nèi)激素水平、 調(diào)節(jié)免疫等藥理作用。 本實(shí)驗(yàn)基于炎癥可誘發(fā)抑郁癥的認(rèn)識(shí)及逍遙散具有一定抗炎作用的基礎(chǔ)， 在體內(nèi)、 體外實(shí)驗(yàn)采用脂多糖誘導(dǎo)抑郁樣行為， 觀察逍遙散對(duì)其影響， 以期為相關(guān)臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)C57BL／6J 小鼠， 雄性， 體質(zhì)量18～22 g； SPF 級(jí)新生24 h SD 乳鼠； SPF 級(jí)SD 大鼠， 雄性， 體質(zhì)量180～220 g， 均由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供， 合格證號(hào) SCXK （川）2013-24。

1.2 藥物 逍遙散藥材飲片（柴胡、 當(dāng)歸、 白芍、 白術(shù)、 茯苓、 薄荷、 生姜、 甘草） 購自成都太極大藥房。 水煎液制備方法為按方劑組成要求[1］取相應(yīng)量藥材， 8 倍量水浸泡30 min， 加熱煮沸后文火煎煮60 min， 趁熱過濾藥液， 再加6 倍量水同法分別煎煮40、 30 min， 合并3 次濾液，60 ℃下減壓濃縮至所需濃度（1.5 g 生藥／mL），生藥量分別為30、 15 g／kg， 相當(dāng)于成人臨床日用量的30、 15 倍。 含藥血清制備方法為將大鼠按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為空白組和逍遙散高劑量組（30 g／kg）， 連續(xù)灌胃給藥7 d， 每天1 次， 末次給藥1 h后麻醉大鼠， 腹主動(dòng)脈取血， 3 500 r／min 離心10 min， 分 離 血 清， 每 組 混 合， 56 ℃水 浴30 min滅活， 0.22 μm 微孔濾膜過濾分裝， -20 ℃下冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑 鹽酸氟西汀膠囊（法國Patheon 公司，20 mg， 國藥準(zhǔn)字J20130010， 批號(hào)6607A）； 鹽酸氟 西 汀 （批 號(hào) SLBM4298V）、 脂 多 糖 （批 號(hào)086M4159V）、 DAPI （批號(hào)066M4053V） （美國Sigma 公 司）； Hanks 液 （批 號(hào)1752164）、 B-27（批號(hào)1813319）、 L-谷氨酰胺 （批號(hào)1816803）、Neurobasal-A 培養(yǎng)基（批號(hào)1852901） （美國Gibco公司）； 胎牛血清（呼和浩特市草原綠野生物工程材料有限公司， 批號(hào)150501）； DMEM 培養(yǎng)基（美國HyClone 公司， 批號(hào)AB10134657）； 小鼠IL-6、TNF-α， 大鼠TNF-α ELISA 試劑盒（欣博盛生物科技有限公司， 批號(hào)M170221-004a、 M170221-102a、R170110-102a）； 小鼠IL-6、 TNF-α， 大鼠TNF-α、IL-6 ELISA 試劑盒（上海依科賽生物制品有限公司， 批 號(hào)21G137、 21G152、 21G128、 21G156）；小鼠IDO、 5-HT， 大鼠5-HT、 IDO ELISA 試劑盒（南京建成生物工程研究所， 批號(hào)01／2018、 01／2018、 02／2018、 02／2018）； NO 檢測(cè)試劑盒 （批號(hào)081216161111）、 乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（批號(hào)112316170306） （上海碧云天生物技術(shù)有限公司）； 兔源NeuN 單克隆抗體（美國Cell signaling Technology 公司， 貨號(hào)5292S、 24307S）； 山羊抗兔IgG／Cy3 [愛必信（上海） 生物科技有限公司， 批 號(hào)10、 AG04017512］； FastQuant RT Kit（Witn gDNase） 100rxn （批號(hào)Q5725）、 SuperReal PreMix Plus （SYBR Green） 20 μL×500rxn （批號(hào)Q5516） [天根生化科技（北京） 有限公司］。

1.4 儀器 3001 型酶標(biāo)儀、 3111 二氧化碳培養(yǎng)箱、 ST16R 冷凍離心機(jī)、 NanoDrop2000 超微量分光光度計(jì) （美國Thermo Fisher Scientific 公司）；TS-200 小鼠懸尾測(cè)試儀 （成都泰盟科技有限公司）； FV1200 激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公 司）； iCycler iOMulticolor Real-Time PCR Dectection System （美國Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 逍遙散對(duì)脂多糖致炎性抑郁樣小鼠的影響 取C57BL／6 J 小鼠， 適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d 后按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為空白組、 模型組、 氟西汀組（3.03 mg／kg） 及 逍 遙 散 低、 高 劑 量 組 （15、30 g／kg）， 以0.02 mL／g 劑量連續(xù)灌胃給藥12 d，每天1 次， 空白組、 模型組給予等體積蒸餾水， 第11 天除空白組外， 其余各組小鼠腹腔注射脂多糖（1 mg／kg） 造模， 共2 次， 每次間隔30 min， 空白組小鼠腹腔注射等量生理鹽水[2］。 造模后， 所有小鼠于24 h 內(nèi)完成行為學(xué)測(cè)試， 分批進(jìn)行懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)， 完成行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后小鼠取血分離血清， ELISA 法檢測(cè)血清IL-6、 TNF-α 水平， 再剖取大腦皮層和海馬組織， 4%多聚甲醛固定后制切片， 尼氏染色法觀察海馬神經(jīng)元尼氏小體數(shù)，Image-Pro plus 圖像分析軟件測(cè)定海馬CA3 區(qū)尼氏小體（×400） 表達(dá)平均光密度； 另取1 批大腦皮層和海馬組織， PBS 緩沖液制備0.1 g／mL 組織勻漿， 離心， 收集上清液， ELISA 法檢測(cè)IL-6、 TNFα、 5-HT、 IDO 水平。

2.2 逍遙散含藥血清對(duì)脂多糖致海馬神經(jīng)元細(xì)胞炎癥模型的影響

2.2.1 海馬神經(jīng)元細(xì)胞鑒定 將新生24 h 的SD乳鼠頸椎脫臼處死， 75%酒精消毒后置于盛有PBS液的平皿內(nèi)， 剪開頭部皮膚， 迅速剝離海馬并置于冰冷PBS 液中， 移至盛有少量Hanks 液的小瓶中，眼科剪將組織剪成糜狀， 加入0.25% 胰蛋白酶，37 ℃下消化25 min， 棄上清后用PBS 洗2 次， 每次5 min， 棄上清， 用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基終止消化， 反復(fù)吹打制成細(xì)胞懸液， 過150 目網(wǎng)篩， 收集細(xì)胞濾液， 離心（1 100 r／min、 4 ℃）5 min， 棄上清液， 加入適量含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。 然后， 血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞， 調(diào)節(jié)細(xì)胞密度5×105／mL， 接種神經(jīng)細(xì)胞懸液于預(yù)先用poly-L-lysine 包被的48 孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔350 μL， 37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后， 全量更換為含2% B-27、 1% L-谷氨酰胺的Neurobasal-A 培養(yǎng)液， 以后每3 d 半量換液。 再觀察海馬神經(jīng)元生長形態(tài)[3］， 并將培養(yǎng)12 d 的海馬神經(jīng)細(xì)胞用NeuN （1 ∶50 稀釋） 一抗和Cy3 （1 ∶100 稀釋） 二抗孵育， 1 μg／mL DAPI 染核， 激光共聚焦顯微鏡下觀察鑒定神經(jīng)元。

2.2.2 含藥血清對(duì)脂多糖致海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷模型炎癥和色氨酸代謝通路的影響 按“2.2.1”項(xiàng)下方法體外培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞， 細(xì)胞在第7～10 天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期， 將細(xì)胞隨機(jī)分為空白組、 模型組、 氟西汀組 （10 μmol／L） 及空白血清、 含藥血清低、 高劑量組（4%、 8%）， 培養(yǎng)至第10 天， 將含5 μg／mL 脂多糖的培養(yǎng)基加入除空白組以外的各組培養(yǎng)孔中造模， 空白組加入不含B-27 的Neurobasal-A 培養(yǎng)基， 每孔350 μL。 24 h后， 各組細(xì)胞給予含氟西汀（10 μmol／L）、 空白血清 （4%、 8%）、 含藥血清 （4%、 8%）， 不含B-27 的Neurobasal-A 培養(yǎng)液， 空白組、 模型組均加入不含B-27 的Neurobasal-A 培養(yǎng)液， 每孔350 μL， 培養(yǎng)至第13 天， 收集上清， 檢測(cè)NO、IL-6、 TNF-α 水平； 收集裂解液， ELISA 法檢測(cè)5-HT、 IDO 水平； 提取各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞總RNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法測(cè)定IL-6、 TNF-α、 5-HT1A、IDO1 mRNA 表達(dá)， 所有引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司設(shè)計(jì)合成， 引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 21.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以s） 表示， 符合正態(tài)分布者， 采用單因素方差分析或獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)； 不符合者， 采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。 以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 逍遙散對(duì)不動(dòng)時(shí)間的影響 表2 顯示， 與空白組比較， 模型組小鼠2 個(gè)實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間顯著延長（P＜0.05， P＜0.01）； 與模型組比較， 逍遙散高劑量組2 個(gè)實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間顯著縮短 （P ＜0.01）， 低劑量組強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間顯著縮短（P＜0.01）。

表2 逍遙散對(duì)不動(dòng)時(shí)間的影響s， n=6～7）Tab.2 Effect of Xiaoyao Powder on immobility time s， n=6-7）

表2 逍遙散對(duì)不動(dòng)時(shí)間的影響s， n=6～7）Tab.2 Effect of Xiaoyao Powder on immobility time s， n=6-7）

注：與空白組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01；與模型組比較，?P ＜0.05，??P＜0.01

空白組 — 178.24±6.82 121.55±13.92模型組 — 213.13±8.51## 141.97±12.17#氟西汀組 3.03 mg／kg 124.80±46.58?? 124.07±9.33?逍遙散組 15 196.69±19.29 98.48±17.27??逍遙散組 30 171.15±4.16?? 74.18±19.44??

3.2 逍遙散對(duì)IL-6、 TNF-α 水平的影響 表3 顯示， 與空白組比較， 模型組血清、 皮層IL-6、 TNF-α 水平及海馬IL-6 水平顯著升高（P ＜0.05， P ＜0.01）； 與模型組比較， 逍遙散組血清IL-6 水平顯著降低（P＜0.05）， 皮層TNF-α、 IL-6 水平顯著下調(diào)（P＜0.05， P＜0.01）， 并且低劑量組海馬IL-6水平顯著降低（P＜0.05）。

3.3 逍遙散對(duì)5-HT、 IDO 水平的影響 表4 顯示， 與空白組比較， 模型組海馬、 皮層5-HT 水平顯著降低（P＜0.05， P＜0.01）， 皮層IDO 水平顯著升高（P＜0.05）； 與模型組比較， 逍遙散組海馬5-HT 水平顯著上調(diào)， 皮層IDO 水平顯著下調(diào)（P＜0.05， P＜0.01）， 并且高劑量組皮層5-HT 水平顯著上調(diào)（P＜0.01）。

表3 逍遙散對(duì)IL-6、 TNF-α 水平的影響 n=4～6）Tab.3 Effects of Xiaoyao Powder on IL-6 and TNF-α levels n=4-6）

表3 逍遙散對(duì)IL-6、 TNF-α 水平的影響 n=4～6）Tab.3 Effects of Xiaoyao Powder on IL-6 and TNF-α levels n=4-6）

注：與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01

組別 劑量／（g·kg-1）皮層IL-6／（pg·mL-1） TNF-α／（pg·mL-1） IL-6／（ng·g-1） TNF-α／（ng·g-1） IL-6／（ng·g-1） TNF-α／（ng·g-1）血清海馬空白組 — 38.73±10.10 81.31±2.13 0.79±0.10 1.07±0.16 0.57±0.07 0.64±0.18模型組 — 82.23±29.99# 91.84±9.60# 1.00±0.16# 1.14±0.22 1.11±0.19## 1.12±0.15#氟西汀組3.03 mg／kg 39.65±1.95? 84.16±2.30 0.80±0.27 1.02±0.15 0.78±0.09?? 0.74±0.09?逍遙散組 15 48.54±14.14? 88.48±5.30 0.74±0.17? 0.99±0.18 0.65±0.13?? 0.62±0.07?逍遙散組 30 48.41±14.22? 90.15±0.22 0.75±0.34 1.32±0.39 0.59±0.21?? 0.64±0.02?

表4 逍遙散對(duì)5-HT、 IDO 水平的影響， n=5）Tab.4 Effects of Xiaoyao Powder on 5-HT and IDO levels ， n=5）

表4 逍遙散對(duì)5-HT、 IDO 水平的影響， n=5）Tab.4 Effects of Xiaoyao Powder on 5-HT and IDO levels ， n=5）

注：與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01

空白組 — 708.46±218.79 85.15±20.93 627.02±53.56 63.46±41.28模型組 — 412.67±98.44# 142.52±58.81 353.97±32.86## 127.06±30.13#氟西汀組 3.03 mg／kg 688.66±56.07?? 120.58±42.74 616.72±135.61?? 57.93±35.28?逍遙散組 15 671.32±69.07?? 138.55±54.53 366.62±23.98 86.51±17.25?逍遙散組 30 742.88±105.51?? 126.23±56.25 653.29±132.60?? 65.57±43.17?

3.4 逍遙散對(duì)尼氏小體的影響 表5、 圖1 顯示，與空白組比較， 模型組小鼠海馬神經(jīng)元損傷， 排列不規(guī)則， 分層不清楚， 尼氏小體數(shù)減少， 呈較明顯空泡狀， 平均光密度顯著降低（P＜0.01）； 與模型組比較， 逍遙散高劑量組平均光密度顯著增加（P＜0.05）。

表5 逍遙散對(duì)尼氏小體的影響±s， n=6）Tab.5 Effect of Xiaoyao Powder on Nissl bodies n=6）

表5 逍遙散對(duì)尼氏小體的影響±s， n=6）Tab.5 Effect of Xiaoyao Powder on Nissl bodies n=6）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01

組別 劑量／（g·kg-1） 平均光密度空白組 — 48.14±5.03模型組 — 28.69±3.40##氟西汀組 3.03 mg／kg 39.37±4.96??逍遙散組 15 31.48±2.34逍遙散組 30 33.03±7.90?

3.5 大鼠原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞體外生長形態(tài)觀察及鑒定 海馬神經(jīng)元細(xì)胞接種24 h 后， 其中有很多神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞， 其胞體較小， 數(shù)量較少， 再進(jìn)行全量更換為Neurobasal-A 培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h 后， 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少， 海馬神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目增多，而且胞體飽滿。 隨著培養(yǎng)時(shí)間延長， 神經(jīng)元細(xì)胞純度更高， 長出神經(jīng)突觸， 并呈現(xiàn)聚團(tuán)生長， 胞體飽滿， 有光澤， 細(xì)胞生長到第10 天時(shí)細(xì)胞聚集成團(tuán)，神經(jīng)突觸明顯增長。

NeuN 是神經(jīng)元特異標(biāo)記物， 神經(jīng)元細(xì)胞可被NeuN-Cy3 標(biāo)記為紅色。 圖2 顯示， 經(jīng)NeuN、 DAPI雙染色后， 培養(yǎng)12 d 的細(xì)胞紅色、 藍(lán)色熒光分布基本重合， 表明所培養(yǎng)細(xì)胞為成熟神經(jīng)元細(xì)胞， 純度可達(dá)95%以上。

圖1 逍遙散對(duì)尼氏小體的影響（×400）Fig.1 Effect of Xiaoyao Powder on Nissl bodies （×400）

3.6 含藥血清對(duì)NO、 IL-6、 TNF-α水平的影響 表6 顯示， 與空白組比較， 模型組NO、 IL-6、 TNF-α 水平顯著升高 （P ＜0.01）； 與模型組比較， 含藥血清高劑量組三者水平顯著下調(diào)（P＜0.01）。

圖2 大鼠原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞鑒定Fig.2 Identification of primary hippocampalneuron cells in rats

表6 含藥血清對(duì)NO、 IL-6、 TNF-α 水平的影響=4～6）Tab.6 Effects of medicated serum on NO， IL-6 and TNF-α levels=4-6）

表6 含藥血清對(duì)NO、 IL-6、 TNF-α 水平的影響=4～6）Tab.6 Effects of medicated serum on NO， IL-6 and TNF-α levels=4-6）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，??P＜0.01；與空白血清高劑量組比較，△P＜0.05

空白組 — 1.27±0.08 223.45±19.71 18.86±1.70模型組 — 13.74±0.70## 1 671.91±30.74## 40.47±2.62##氟西汀組 10 μmol／L 7.60±1.15?? 268.01±19.58?? 38.36±4.97空白血清組 4 10.04±1.63 1 407.85±173.19 38.65±2.77含藥血清組 4 11.55±1.97 1 635.90±69.67 36.14±7.45空白血清組 8 10.63±2.35 1 641.56±9.92 39.26±6.72含藥血清組 8 8.73±1.31?? 1 312.48±113.83??△ 28.20±7.89??△

3.7 含藥血清對(duì)5-HT、 IDO 水平的影響 表7 顯示， 與空白組比較， 模型組5-HT 水平顯著降低（P＜0.05）， IDO 表達(dá)顯著增加（P＜0.01）； 與模型組比較， 含藥血清高劑量組5-HT 水平顯著上調(diào)， IDO 水平顯著下調(diào)（P＜0.01）， 低劑量組IDO水平顯著下調(diào)（P＜0.01）。

3.8 含藥血清對(duì)IL-6、 TNF-α mRNA 表達(dá)的影響 表8 顯 示， 與 空 白 組 比 較， 模 型 組IL-6、TNF-α mRNA 表達(dá)顯著增加（P＜0.05， P＜0.01）；與模型組比較， 含藥血清組兩者mRNA 表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05， P＜0.01）。

表7 含藥血清對(duì)5-HT、 IDO 水平的影響（x±s， n=5～6）Tab.7 Effects of medicated serum on 5-HT and IDO levels±s， n=5-6）

表7 含藥血清對(duì)5-HT、 IDO 水平的影響（x±s， n=5～6）Tab.7 Effects of medicated serum on 5-HT and IDO levels±s， n=5-6）

注：與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，??P＜0.01；與空白血清低劑量組比較，▲P＜0.05；與空白血清高劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

空白組 — 51.66±16.17 1.22±0.21模型組 — 29.77±11.41# 1.65±0.16##氟西汀組 10 μmol／L 57.95±13.24?? 0.79±0.18??空白血清組 4 29.52±5.37 2.04±0.64含藥血清組 4 43.77±14.92 1.12±0.14??▲空白血清組 8 20.21±4.88 2.13±0.66含藥血清組 8 74.82±8.51??△△ 1.25±0.09??△

表8 含藥血清對(duì)IL-6、 TNF-α mRNA 表達(dá)的影響，n=4～5）Tab.8 Effects of medicated serum on IL-6 and TNF-α mRNA expressions s， n=4-5）

表8 含藥血清對(duì)IL-6、 TNF-α mRNA 表達(dá)的影響，n=4～5）Tab.8 Effects of medicated serum on IL-6 and TNF-α mRNA expressions s， n=4-5）

注：與空白組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01；與模型組比較，?P ＜0.05，??P＜0.01；與空白血清低劑量組比較，▲▲P＜0.01；與空白血清高劑量組比較，△P＜0.01， △P＜0.05

空白組 — 1.04±0.40 1.20±0.38模型組 — 7.49±1.09## 9.73±2.01#氟西汀組 10 μmol／L 4.43±0.92?? 4.08±1.09空白血清組 4 5.87±1.10 7.17±0.42含藥血清組 4 1.52±0.18??▲▲ 0.86±0.30?▲▲空白血清組 8 6.09±0.58 7.06±0.76含藥血清組 8 2.15±0.14??△△ 1.07±0.03?△

3.9 含藥血清對(duì)5-HT1A、 IDO1 mRNA 表達(dá)的影響 表9 顯示， 與空白組比較， 模型組5-HT1A mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.01）， IDO1 mRNA 表達(dá)顯著升高（P＜0.01）； 與模型組比較， 含藥血清組5-HT1A mRNA 水平顯著上調(diào)（P＜0.01）， IDO1 mRNA 水平顯著下調(diào)（P＜0.01）。

表9 含藥血清對(duì)5-HT1A、 IDO1 mRNA 表達(dá)的影響（x±s， n=4～5）Tab.9 Effects of medicated serum on 5-HT1A and IDO1 mRNA expressionss， n=4-5）

表9 含藥血清對(duì)5-HT1A、 IDO1 mRNA 表達(dá)的影響（x±s， n=4～5）Tab.9 Effects of medicated serum on 5-HT1A and IDO1 mRNA expressionss， n=4-5）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，??P＜0.01；與空白血清低劑量組比較，▲▲P ＜0.01；與空白血清高劑量組比較，△P ＜0.01，△P＜0.05

空白組 — 1.04±0.01 0.87±0.39模型組 — 0.34±0.05## 2.17±0.19##氟西汀組 10 μmol／L 0.76±0.05?? 0.99±0.30??空白血清組 4 0.35±0.03 1.92±0.17含藥血清組 4 0.57±0.09??▲▲ 0.74±0.23??▲▲空白血清組 8 0.31±0.03 1.82±0.34含藥血清組 8 0.67±0.13??△△ 1.07±0.42??△

4 討論

炎癥反應(yīng)參與了抑郁癥的發(fā)生發(fā)展過程， 細(xì)胞因子水平異常與神經(jīng)精神綜合征發(fā)生存在必然聯(lián)系[4］， 炎性細(xì)胞因子會(huì)通過影響大腦神經(jīng)傳遞和可塑性來觸發(fā)氧化應(yīng)激， 抑制成年神經(jīng)發(fā)生等途徑。 從而誘發(fā)抑郁癥[5］。 脂多糖刺激機(jī)體誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子能激活吲哚胺2， 3-雙加氧酶（IDO）， 它是一種能由IL-6、 IFN -α、 IFN -γ、 TNFα 中1 種或幾種結(jié)合的細(xì)胞因子激活若干炎癥信號(hào)通路激活的酶， 可導(dǎo)致色氨酸（TRP） 更多地代謝為犬尿氨酸（KYN）， 進(jìn)而引起神經(jīng)毒性產(chǎn)物的增加， 抑制海馬神經(jīng)元的可塑性[6-7］， 同時(shí)被色氨酸羥化酶 （TrpH） 和1-芳香族氨基酸脫羧酶 （LAADC） 代謝成5-HT 的色氨酸減少， 導(dǎo)致后者合成水平下降， 并引起強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間延長、 飛濺測(cè)試梳洗時(shí)間減少等抑郁樣行為， 給予細(xì)胞因子抑制劑米諾環(huán)素后能間接阻斷IDO 激活， 表現(xiàn)出阻止抑郁癥的發(fā)展[8］。 Corona 等[9］報(bào)道， LPS 誘導(dǎo)的IDO 激活會(huì)導(dǎo)致趨化因子受體缺陷小鼠（CX3CR1-／-小鼠） 產(chǎn)生抑郁樣行為， 小膠質(zhì)細(xì)胞激活和腦內(nèi)5-HIAA／5-HT 比率增加， 給予IDO 抑制劑1-MT 后可緩解該狀況。 另外， 非甾體抗炎藥物阿司匹林也能在通過下調(diào)細(xì)胞因子（IL-6、 TNFα） 釋放來減輕炎性反應(yīng)的同時(shí)， 縮短SD 大鼠強(qiáng)迫游泳的不動(dòng)時(shí)間從而緩解抑郁樣行為[10］。

逍遙散具有良好的抗抑郁作用， 方中君藥柴胡有效成分柴胡皂苷抗炎作用明顯[11］， 其機(jī)制與抑制炎 癥 介 質(zhì) （IL-1、 IL-6、 TNF-α 等） 釋 放 有關(guān)[12］； 臣藥當(dāng)歸、 白芍均具有抗炎作用， 前者所含阿魏酸能提高吞噬細(xì)胞功能， 抑制IL-1β、 JNK信號(hào)通路來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用， 而后者所含芍藥苷、 牡丹酚等可抑制IL-6、 TNF-α 等炎性因子分泌； 佐藥白術(shù)、 茯苓、 生姜[13］、 薄荷[14］， 以及使藥甘草[15］均可通過抑制炎癥因子釋放來發(fā)揮抗炎作用， 有效成分包括白術(shù)內(nèi)酯、 茯苓多糖、 姜黃素、 薄荷酮、 甘草黃酮等。 課題組前期采用二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)及醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高實(shí)驗(yàn)， 也發(fā)現(xiàn)逍遙散具有一定抗炎作用， 顯示出其處方藥物抗炎作用的整合表現(xiàn)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 脂多糖刺激可引起小鼠出現(xiàn)懸尾、 強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間延長等抑郁樣行為， 而且小鼠血清、 皮質(zhì)、 海馬中IL-6、 TNF-α 水平明顯升高， 提示抑郁樣行為與IL-6、 TNF-α 水平升高存在一定相關(guān)性； 它也可誘導(dǎo)小鼠皮層、 海馬中IDO水平上調(diào)， 5-HT 水平下降， 海馬CA3 區(qū)錐體細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則， 細(xì)胞間隙增大， 排列不齊， 甚至尼氏小體消失， 提示該模型小鼠抑郁樣行為發(fā)生與炎性反應(yīng)有關(guān)； 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示， 逍遙散能縮短模型小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)、 懸尾實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間， 降低外周及中樞皮層、 海馬IL-6、 TNF-α、 IDO 水平， 提高5-HT 水平； 體外實(shí)驗(yàn)顯示， 含藥血清可對(duì)抗脂多糖誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞炎性因子異常釋放及其mRNA表達(dá)， 并提高模型細(xì)胞5-HT 分泌水平及5-HT1A mRNA 的表達(dá)。

綜上所述， 逍遙散對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥抑郁樣模型有對(duì)抗作用， 其機(jī)制可能與直接上調(diào)5-HT 水平及其受體功能， 或通過阻斷炎性因子誘導(dǎo)的IDO 激活途徑來抑制TRP-KYN 代謝途徑， 促使更多TRP 向5-HT 轉(zhuǎn)化， 并同時(shí)降低KYN 及其下游神經(jīng)元毒性代謝物的產(chǎn)生， 或保護(hù)神經(jīng)元、 促神經(jīng)元增殖分化有關(guān)。 同時(shí)也進(jìn)一步表明， 逍遙散的抗抑郁作用是多途徑、 多靶點(diǎn)模式。