七十味珍珠丸對腦缺血再灌注損傷大鼠血腦屏障的保護(hù)作用

梁 源， 孫位軍， 王 張， 賈曉靜， 胥培艷， 付 珂， 徐文龍

（1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 四川 成都 611137； 2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院， 四川 成都 611137）

腦缺血屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)急癥之一， 近年來發(fā)病率有明顯升高的趨勢， 具有恢復(fù)慢、 致殘率和致死率高的特點(diǎn)[1-3］， 發(fā)生缺血性中風(fēng)的主要原因是血栓形成后堵塞血管， 引起腦血流量降低， 進(jìn)而使腦組織發(fā)生缺血缺氧、 軟化甚至壞死[4］， 而缺血再灌注是導(dǎo)致病情加重的主要原因[3］。 腦缺血再灌注損傷后， 血腦屏障出現(xiàn)結(jié)構(gòu)及功能改變[5］，前者主要表現(xiàn)在對微血管內(nèi)皮細(xì)胞、 星形膠質(zhì)細(xì)胞足突、 基底膜的影響， 對缺血更敏感的膠質(zhì)細(xì)胞足突較微血管率先發(fā)生腫脹和退行性變， 膠質(zhì)細(xì)胞皺縮， 毛細(xì)血管內(nèi)可見出多個(gè)向管腔內(nèi)伸入的呈偽足樣突起； 后者主要表現(xiàn)在通透性變化， 毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙增大導(dǎo)致通透性增加。 在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，可用伊文思藍(lán)來反映血腦屏障功能改變， 其損傷機(jī)制涉及ROS／RNS 損傷[6］、 MMPs 激活[7］、 炎細(xì)胞浸潤[8］、 水通道開放[9］、 鈣超載[10］等。

七十味珍珠丸（藏文譯音然納桑培） 始載于藏醫(yī)經(jīng)典著作《四部醫(yī)典》 中， 由珍珠、 檀香、降香、 九眼石、 西紅花、 牛黃、 麝香等藥材組成，具有安神鎮(zhèn)靜、 通經(jīng)活絡(luò)、 調(diào)和氣血、 醒腦開竅的作用[11］， 主要用于治療“黑白脈病” “龍血不調(diào)”， 以及中風(fēng)、 癱瘓、 半身不遂等疾病[12］， 其中白脈病相當(dāng)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。 經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)， 尚無七十味珍珠丸對腦缺血再灌注損傷動(dòng)物模型血腦屏障保護(hù)作用的報(bào)道， 故本實(shí)驗(yàn)將對此進(jìn)行考察， 并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 試藥 七十味珍珠丸（西藏甘露藏藥股份有限公司， 批號(hào)16044A）； 尼莫地平片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司， 批號(hào)BJ30601）。 SOD 試劑盒（貨號(hào)A001-1）、 MDA 試劑盒（貨號(hào)A003-1） （南京建成生物工程研究所）； 紅四氮唑（上海靈錦精細(xì)化工有限公司， 批號(hào)20160500）； 甲酰胺（成都市科隆化工試劑廠， 批號(hào)2017092901）； 多聚甲醛（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司， 批號(hào)20160512）；甲苯胺藍(lán)（上海如吉生物科技發(fā)展有限公司， 批號(hào)120418）； PBS 緩沖液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司， 批號(hào)ZLI-9062）； 蘇木素（北京百靈威科技有限公司， 批號(hào)LM10N13）； 伊紅（東京化成工業(yè)株式會(huì)社， 批號(hào)GL01-GMPC）； 依文思藍(lán)（上海如吉生物科技發(fā)展有限公司）。 沒食子酸（批號(hào)PS000688）、 柯里拉京（批號(hào)PS000532）、鞣花酸（批號(hào)PS14102401） 對照品（成都普思生物科技股份有限公司， 含有量大于98%）。 乙腈為色譜純（安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰荆?甲醇為分析純（西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司）。

1.2 儀器 電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司］； 紫外可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）； 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司）； 全自動(dòng)生化分析儀（上海特康科技有限公司）； TSJ-Ⅱ型全自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī)、 BMJ-Ⅲ型包埋機(jī)、 PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀（常州市中威電子儀器有限公司）；數(shù)碼三目攝像顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）； LC-2010A HT 型高效液相色譜儀（日本島津公司）。

1.3 動(dòng)物 SPF 級(jí)SD 雄性大鼠72 只， 體質(zhì)量（260±10） g， 購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （川） 2015-030， 四川省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào) 51203500003428、51203500003567 等。

2 方法

2.1 分組與劑量 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、 模型對照組、 尼莫地平片組（30.00 mg／kg）、 七十味珍珠丸組（66.68 mg／kg）， 每組再分為3 個(gè)亞組（腦梗死率、 血腦屏障通透性、 腦組織形態(tài)學(xué)），其中七十味珍珠丸臨床用藥劑量為重病患者每天1 g （1 丸）， 一般患者每隔3 ～7 d 1 g （1 丸）。 前期課題組[12-13］開展七十味珍珠丸抗大鼠腦缺血再灌注損傷的量效關(guān)系（0.52、 1.04、 2.08、 4.17、8.33、 16.67、 33.34、 66.68、 133.36 mg／kg， 分別 為 成 人 用 量 的0.031 25、 0.062 5、 0.125、0.25、 0.5、 1、 2、 4、 8 倍） 及其對線栓致大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的時(shí)效關(guān)系（2、 6、 12、24、 48、 72 h， 劑量為33.50 g／kg， 即臨床成人用量的2 倍） 研究， 發(fā)現(xiàn)66.68 g／kg （臨床成人用量的4 倍） 為最佳劑量， 故本實(shí)驗(yàn)設(shè)置該劑量進(jìn)行研究。

2.2 造模與給藥 參考文獻(xiàn)[14］， 沿大鼠頸部正中線偏右作一切口， 止血鉗鈍性分離淋巴組織及腺體， 在胸骨舌骨肌、 胸鎖乳突肌、 二腹肌后腹交界空隙處分離右側(cè)頸總動(dòng)脈， 在近心端處系1 根縫合線， 止血鉗夾住線頭以起到牽拉作用； 沿頸總動(dòng)脈向大腦方向繼續(xù)分離頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈， 在兩者分叉處結(jié)扎頸外動(dòng)脈， 止血鉗夾住頸外動(dòng)脈的結(jié)扎線以起到牽拉作用， 再沿頸內(nèi)動(dòng)脈往內(nèi)分離翼腭動(dòng)脈， 在分叉處結(jié)扎。 然后， 在頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端的結(jié)扎線和近心端的松結(jié)之間剪一小口， 在自制挑針輔助下將栓線插入到頸內(nèi)動(dòng)脈， 長度約20 mm （從頸總動(dòng)脈分叉處算起）， 縫合手術(shù)創(chuàng)口并消毒， 術(shù)中保溫至大鼠清醒， 大腦中動(dòng)脈阻斷2 h 后進(jìn)行再灌注， 而假手術(shù)組僅在動(dòng)脈處備線處理， 不造模?？紤]到七十味珍珠丸在臨床上每隔3 ～7 d 給藥1次， 具有“緩釋樣效應(yīng)”， 并結(jié)合課題組前期研究結(jié)果[12-13］， 本實(shí)驗(yàn)也僅給藥1 次， 手術(shù)前灌胃給予七十味珍珠丸混懸液、 尼莫地平混懸液或生理鹽水， 給藥體積均為10 mL／kg。

2.3 腦梗死率檢測 大鼠腦缺血24 h 時(shí)麻醉取血后， 立即取出全腦， 濾紙吸干腦組織表面水分稱定質(zhì)量后， 將其置于-20 ℃冰箱中速凍20 ～30 min，用配好的1% TTC 緩沖液染色30 min， 分離梗死組織呈蒼白色部分， 濾紙吸干腦組織表面水分稱定質(zhì)量， 計(jì)算腦梗死率（腦梗死部分質(zhì)量／腦組織質(zhì)量×100%）。

2.4 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 參考Longa[15］、 Bederson[16］的5 分制法， 在大鼠腦缺血后2、 24 h 時(shí)應(yīng)用表1進(jìn)行評(píng)分， 分值越高， 表明大鼠行為障礙越嚴(yán)重。

表1 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分Tab.1 Neurobehavioral scores

2.5 腦組織病理學(xué)評(píng)價(jià)和尼氏小體計(jì)數(shù) 取各組大鼠的缺血側(cè)腦組織， 4%多聚甲醛溶液固定、 脫水、 石蠟包埋， 部分進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE） 染色， 光鏡下觀察腦組織病變程度， 分為“-” （未見病變）、 “＋” [小灶性灰、 白質(zhì)水腫， 細(xì)胞溶解；小灶性灰、 白質(zhì)細(xì)胞萎縮， 胞漿及核深染； 灶性少許細(xì)胞增生（主要為膠質(zhì)細(xì)胞）； 輕度血管周水腫； 輕度血管充血、 出血； 少許炎細(xì)胞浸潤； 輕度灰質(zhì)萎縮??； 少許室管膜細(xì)胞增生］、 “＋＋” [多灶性灰、 白質(zhì)水腫， 細(xì)胞溶解； 灶性灰、 白質(zhì)細(xì)胞胞萎縮， 胞漿及核深染； 灶性較多細(xì)胞增生（主要為膠質(zhì)細(xì)胞）； 中度血管充血、 出血； 較多炎細(xì)胞浸潤。 中度血管周水腫］、 “＋＋＋” [彌漫性灰、白質(zhì)水腫， 細(xì)胞溶解； 多灶性灰、 白質(zhì)細(xì)胞萎縮，胞漿及核深染； 灶性大量細(xì)胞增生（主要為膠質(zhì)細(xì)胞）； 重度血管充血、 出血； 大量炎細(xì)胞浸潤］；部分腦組織用甲苯胺藍(lán)水溶液染色， 光鏡下觀察尼氏小體數(shù)。

2.6 血清SOD、 MDA 水平檢測 大鼠24 h 腹腔注射水合氯醛麻醉， 腹主動(dòng)脈采血5 mL， 離心（3 500 r／min） 10 min 分離血清， 取上清液， 按試劑盒方法測定。

2.7 血腦屏障通透性評(píng)價(jià) 大鼠腦缺血24 h 時(shí)麻醉， 股靜脈緩慢注射2% 伊文思藍(lán) （EB） 溶液（4 mL／kg）， 2 h 后心臟灌注， 迅速斷頭取腦， 去除皮質(zhì)表面蛛網(wǎng)膜、 腦室脈絡(luò)叢， 取缺血側(cè)大腦稱定質(zhì)量， 充分剪碎后置于5 mL 甲酰胺溶液中，60 ℃水浴下靜置24 h， 離心（20 ℃、 12 000 r／min）15 min， 取上清液， 620 nm 波長處測定光密度； 甲酰胺溶液作為空白對照， 配制8、 4、 2、 1、 0.5、0.25、 0.125 μg／mL EB 溶液， 測定光密度， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（Y 為光密度， X 為溶液質(zhì)量濃度） 為Y=17.436X＋0.012 8 （R2=0.999 7）， 計(jì)算腦組織EB 含有量（樣品中EB 含有量×甲酰胺溶液體積／腦組織質(zhì)量）[17-28］。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 21.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（） 表示， 組間比較采用方差分析； 等級(jí)資料組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。 P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 成分分析 采用課題組前期建立的方法[29］，通過HPLC 法進(jìn)行分析， 條件為柱溫30 ℃； 體積流量0.8 mL／min； 檢測波長254 nm； 流動(dòng)相乙腈-0.2%磷酸， 梯度洗脫， 色譜圖見圖1。

3.2 腦梗死率 表2、 圖2 顯示， 與假手術(shù)組比較， 模型對照組腦梗死率顯著增加（P＜0.01）； 與模型對照組比較， 七十味珍珠丸組其梗死率顯著降低（P＜0.01）。

3.3 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 表3 顯示， 與假手術(shù)組比較， 模型對照組在2、 24 h 有顯著的神經(jīng)行為學(xué)異常（P＜0.01）， 表現(xiàn)為大鼠向左轉(zhuǎn)圈、 向左側(cè)傾倒、 左前腳不自然伸直等； 與模型對照組比較， 七十味珍珠丸組在24 h 其異常顯著改善（P＜0.01）。

圖1 七十味珍珠丸HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of Qishiwei Zhenzhu Pills

表2 七十味珍珠丸對腦梗死率的影響 n=6）Tab.2 Effect of Qishiwei Zhenzhu Pills on cerebral infarction rate n=6）

表2 七十味珍珠丸對腦梗死率的影響 n=6）Tab.2 Effect of Qishiwei Zhenzhu Pills on cerebral infarction rate n=6）

注：與假手術(shù)組比較，##P＜0.01；與模型對照組比較，??P＜0.01

假手術(shù)組 — 0.00±0.00模型對照組 — 15.06±1.87##尼莫地平片組 30.00 6.65±3.15??七十味珍珠丸組 66.68 2.77±2.45??

圖2 各組大鼠腦組織Fig.2 Brain tissues of rats in various groups

3.4 尼氏小體數(shù) 表4、 圖3 顯示， 與假手術(shù)組比較， 模型對照組尼氏小體數(shù)顯著減少 （P ＜0.01）； 與模型對照組比較， 七十味珍珠丸組其數(shù)量顯著增加（P＜0.05）。

表3 七十味珍珠丸對神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分的影響s， n=6）Tab.3 Effect of Qishiwei Zhenzhu Pills on neurobehavioral scores ， n=6）

表3 七十味珍珠丸對神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分的影響s， n=6）Tab.3 Effect of Qishiwei Zhenzhu Pills on neurobehavioral scores ， n=6）

注：與假手術(shù)組比較，##P＜0.01；與模型對照組比較，??P＜0.01

假手術(shù)組 — 6 0 0 0 0 — 6 0 0 0 0 —模型對照組 — 0 1 5 0 0 0.001## 0 5 0 1 0 0.001##尼莫地平片組 30.00 0 2 3 1 0 0.923 0 3 3 0 0 0.002??七十味珍珠丸組 66.68 0 0 6 0 0 0.317 0 4 2 0 0 0.002??

表4 七十味珍珠丸對尼氏小體數(shù)的影響 n=6）Tab.4 Effect of Qishiwei Zhenzhu Pills on Nissl body count n=6）

表4 七十味珍珠丸對尼氏小體數(shù)的影響 n=6）Tab.4 Effect of Qishiwei Zhenzhu Pills on Nissl body count n=6）

注：與假手術(shù)組比較，##P＜0.01；與模型對照組比較，?P＜0.05

假手術(shù)組 — 76.78±5.62模型對照組 — 60.39±5.07##尼莫地平片組 30.00 62.67±8.16七十味珍珠丸組 66.68 71.39±9.14?

3.5 腦組織病理變化 表5、 圖4 顯示， 與假手術(shù)組比較， 模型對照組大鼠缺血側(cè)腦組織灰質(zhì)和海馬神經(jīng)細(xì)胞水腫、 空泡變性明顯， 細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，呈腦缺血、 缺氧性改變（P＜0.01）； 與模型對照組比較， 七十味珍珠丸組細(xì)胞變性、 水腫程度均有一定程度減輕， 但無顯著性差異（P＞0.05）。

表5 七十味珍珠丸對病理切片等級(jí)的影響（x ±s， n=6）Tab.5 Effect of Qishiwei Zhenzhu Pills on pathological section grade ±s， n=6）

表5 七十味珍珠丸對病理切片等級(jí)的影響（x ±s， n=6）Tab.5 Effect of Qishiwei Zhenzhu Pills on pathological section grade ±s， n=6）

注：與假手術(shù)組比較，##P＜0.01

假手術(shù)組 — 4 2 0 0 —模型對照組 — 0 1 5 0 0.004##尼莫地平片組 30.00 1 1 4 0 0.461七十味珍珠丸組 66.68 1 2 3 0 0.211

3.6 SOD 活性、 MDA 水平 表6 顯示， 與假手術(shù)組比較， 模型對照組SOD 活性、 MDA 水平無明顯變化（P＞0.05）； 與模型對照組比較， 七十味珍珠丸組兩者有降低趨勢， 但無顯著差異（P＞0.05）。

圖3 各組大鼠腦組織顯微圖（尼氏染色， ×400）Fig.3 Micrographs for brain tissues of rats in various groups （Nissl staining， ×400）

圖4 各組大鼠組織病理形態(tài)（HE 染色， ×400）Fig.4 Histopathologic morphologies of rats in various groups （HE staining， ×400）

表6 七十味珍珠丸對SOD 活性、 MDA 水平的影響 n=6）Tab.6 Effects of Qishiwei Zhenzhu Pills on SOD activity and MDA level （s， n=6）

表6 七十味珍珠丸對SOD 活性、 MDA 水平的影響 n=6）Tab.6 Effects of Qishiwei Zhenzhu Pills on SOD activity and MDA level （s， n=6）

注：與模型對照組比較，?P＜0.05

組別 劑量／（mg·kg-1） SOD／（U·mL-1） MDA／（mmol·mL-1）假手術(shù)組 — 325.163 3±28.740 2 3.881 0±1.496 9模型對照組 — 332.338 8±25.298 8 3.976 3±1.236 9尼莫地平片組 30.00 390.565 0±52.725 1? 2.047 5±0.932 9?七十味珍珠丸組 66.68 328.238 5±33.880 2 3.333 3±1.244 4

3.7 血腦屏障通透性 表7、 圖5 顯示， 與假手術(shù)組比較， 模型對照組EB 含有量顯著升高（P＜0.01）； 與模型對照組比較， 七十味珍珠丸組其含有量顯著降低（P＜0.05）。

4 討論

尼氏染色是觀察缺血腦組織內(nèi)神經(jīng)元尼氏體的經(jīng)典方法[30］， 染色結(jié)果表明， 模型對照組大鼠缺血側(cè)腦組織尼氏小體受損嚴(yán)重、 溶解或消失明顯，而七十味珍珠丸組大鼠缺血側(cè)腦組織尼氏小體數(shù)量增加。 HE 染色結(jié)果表明， 模型對照組大鼠缺血側(cè)大腦灰質(zhì)水腫， 染色較淡， 透光度增強(qiáng)， 各細(xì)胞層排列紊亂， 細(xì)胞空泡變性， 胞漿疏松、 腫脹， 細(xì)胞呈不規(guī)則形， 細(xì)胞核濃縮深染， 部分可見小膠質(zhì)細(xì)胞增生， 其中2 例（2／6） 海馬結(jié)構(gòu)較完整， 海馬椎體細(xì)胞固縮、 深染、 核仁模糊， 少量椎體細(xì)胞壞死； 七十味珍珠丸組大鼠缺血側(cè)大腦灰質(zhì)水腫或空泡變性， 染色透光度增強(qiáng)， 細(xì)胞胞漿疏松、 腫脹變性， 胞核濃縮深染， 偶見有小膠質(zhì)細(xì)胞增生， 其中2 例（2／6） 海馬組織水腫變性、 染色淺， 椎體細(xì)胞排列紊亂、 極向不清， 椎體細(xì)胞胞質(zhì)腫脹、 疏松， 胞膜邊界模糊不清， 有改善趨勢。 TTC 染色結(jié)果表明， 模型對照組大鼠腦梗死率增加， 而七十味珍珠丸組其明顯降低。 神經(jīng)行為學(xué)結(jié)果表明， 模型對照組大鼠在2、 24 h 神經(jīng)行為學(xué)明顯異常， 而七十味珍珠丸大鼠上述異常明顯改善。 綜上所述， 七十味珍珠丸對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織有明顯保護(hù)作用。

表7 七十味珍珠丸對EB 含有量的影響±s， n=6）Tab.7 Effect of Qishiwei Zhenzhu Pills on EB contents， n=6）

表7 七十味珍珠丸對EB 含有量的影響±s， n=6）Tab.7 Effect of Qishiwei Zhenzhu Pills on EB contents， n=6）

注：與假手術(shù)組比較，##P＜0.01；與模型對照組比較，?P＜0.05，??P＜0.01

假手術(shù)組 — 3.867 8±2.734 0模型對照組 — 11.794 3±2.423 0##尼莫地平片組 30.00 7.622 6±1.883 5??七十味珍珠丸組 66.68 7.953 8±1.911 0?

圖5 各組大鼠血腦屏障通透性Fig.5 Blood-brain barrier permeabilities of rats in various groups

血腦屏障是維持腦內(nèi)微環(huán)境的穩(wěn)定、 保證大腦正常功能的特殊屏障， 在向腦內(nèi)進(jìn)行營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸、 阻擋有害物質(zhì)進(jìn)入大腦中發(fā)揮著重要作用， 主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞、 星形膠質(zhì)細(xì)胞、 細(xì)胞外基質(zhì)共同組成1 個(gè)緊密結(jié)構(gòu)[4，21-32］， 其損傷將直接導(dǎo)致神經(jīng)元所處生理環(huán)境改變， 并伴隨神經(jīng)炎癥發(fā)生、 氧化應(yīng)激、 腦水腫等現(xiàn)象[33-34］， 最終會(huì)引起突觸和神經(jīng)元功能紊亂[35］， 而且腦缺血再灌注損傷將導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)受損， 通透性增加[5］。 本實(shí)驗(yàn)采用伊文思藍(lán)透過法檢測血腦屏障通透性， 發(fā)現(xiàn)模型對照組大鼠腦組織EB 含有量明顯升高， 表明可造成血腦屏障損傷， 通透性增加； 七十味珍珠丸組其含有量明顯降低， 通透性減少， 表明它對血腦屏障有保護(hù)作用。

活性自由基能氧化細(xì)胞膜和基底膜上的不飽和脂肪酸， 引起血管內(nèi)皮細(xì)胞和基底膜損傷， 從而破壞血腦屏障完整性[12］， 而MDA 是主要脂質(zhì)過氧化物， 能使細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生破壞[36］。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與模型對照組比較， 七十味珍珠丸組大鼠血清SOD 活性、 MDA 水平有降低趨勢， 表明其保護(hù)血腦屏障的作用機(jī)制可能與氧化應(yīng)激有關(guān)。

七十味珍珠丸組方多， 而且為保密處方， 對血腦屏障發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制較復(fù)雜。 本實(shí)驗(yàn)從血腦屏障通透性角度進(jìn)行考察， 可為今后研究七十味珍珠丸ROS／RNS-MMPs-TJs 信號(hào)通路提供參考。