都梁方中揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物的制備

韋小翠， 楊書婷， 張 焱， 朱宇超， 顏媛媛， 程建明， 柳春娣

（1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 江蘇省中藥功效物質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 南京 210023； 2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬張家港醫(yī)院， 江蘇 張家港 215600）

都梁方最早記載于宋代《是齋百一選方》， 為王璆博采民間驗(yàn)方而來， 原方由白芷研末加煉蜜為丸而成， 后人在此基礎(chǔ)上加川芎煉蜜為丸（1983年版《北京市藥品標(biāo)準(zhǔn)》 ）， 即“都梁丸”[1］， 現(xiàn)收載于2015 年版《中國藥典》， 用于治療風(fēng)寒之邪上犯頭部、 清陽之氣受阻、 氣血凝滯引起的頭痛[2-4］。 方中白芷、 川芎均含有揮發(fā)油， 前者具有明顯的鎮(zhèn)痛、 鎮(zhèn)靜、 抗過敏作用[5］， 而后者有著解熱、 鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、 改善血流變、 保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、 抗炎、 降壓等活性[6］， 兩者藥效與全方基本相符，即是有效成分， 但該類成分具有揮發(fā)性， 而且在氧、 光、 熱的作用下極易分解變質(zhì)， 有不易貯存、生物利用度低等缺點(diǎn)。 因此， 本實(shí)驗(yàn)制備都梁方中揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物， 使液體藥物粉末化， 增加揮發(fā)油穩(wěn)定性， 以便進(jìn)一步制成不同劑型， 為今后相關(guān)研究提供基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）； 高速分散儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）； KQ-500DE 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海維誠儀器有限公司）；Biomate 3S 紫外可見分光光度計(jì)、 Nicolet is5 傅立葉變換紅外光譜儀[賽默飛世爾科技（中國） 有限公司］。

1.2 試藥 揮發(fā)油 （自制）。 β-環(huán)糊精 （批號Z28F8Y30171 ）、 羥 丙 基-β-環(huán) 糊 精 （ 批 號Y15S8C43689） （上海源葉生物科技有限公司）；水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油提取 采用水蒸氣蒸餾法。 按照前期預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的最優(yōu)工藝， 即粉碎12 ～24 目， 加10倍量水浸泡0.5 h 后提取6 h， 得淡黃色油狀液體，加入無水硫酸鈉脫水， 5 000 r／min 離心5 min 后，移取上層液體， 即得。

2.2 含油量測定（紫外分光光度法）[7］

2.2.1 方法學(xué)考察

2.2.1.1 檢測波長篩選 精密稱取揮發(fā)油約0.5 g， 置于100 mL 量瓶中， 無水乙醇定容至刻度。 另外精密稱取β-環(huán)糊精、 包合物各約0.5 g，置于50 mL 錐形瓶中， 精密加入20 mL 無水乙醇，超聲30 min 后過濾， 續(xù)濾液稀釋至一定質(zhì)量濃度后測定， 以無水乙醇為空白， 在200 ～400 nm 波長范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描。 結(jié)果， 揮發(fā)油、 包合物提取液在320 nm 波長處均有最大吸收， 吸收曲線相似， 而β-環(huán)糊精提取液在該該處沒有吸收， 不干擾測定， 故選擇檢測波長為320 nm。

2.2.1.2 線性關(guān)系考察 精密移取揮發(fā)油0.5 g，置于100 mL 量瓶中， 無水乙醇稀釋至刻度， 精密移取1 mL 置于50 mL 量瓶中， 無水乙醇定容， 作為對照溶液， 再精密吸取1.5、 2.0、 2.5、 3.0、3.5、 4.0、 4.5 mL 置于10 mL 量瓶中， 無水乙醇定容至刻度， 搖勻， 在320 nm 波長處測定吸光度。以吸光度（A） 對揮發(fā)油質(zhì)量濃度（X） 進(jìn)行回歸， 得方程為A=16 829X＋0.001 96 （r=0.999 5），在1.5×10-5～4.5×10-5g／mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.1.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取對照溶液適量，按“2.2.1.2” 項(xiàng)下方法測定吸光度， 重復(fù)5 次，測得其RSD 為0.33%， 表明儀器精密度良好。

2.2.1.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取包合物5 份， 每份約0.5 g， 精密加入20 mL 60% 乙醇， 超聲30 min后過濾， 精密吸取適量續(xù)濾液， 60%乙醇稀釋至適當(dāng)質(zhì)量濃度， 在320 nm 波長處測定吸光度，測得其RSD 為0.41%， 表明該方法重復(fù)性較好。

2.2.1.5 加樣回收率試驗(yàn) 取含油量已知的包合物9 份， 分為3 組， 分別按50%、 100%、 150%水平加入揮發(fā)油， 測定含油量。 結(jié)果， 平均加樣回收率為97.5%， RSD 為0.70%。

2.2.2 測定方法 精密稱取包合物約0.5 g， 精密加入20 mL 60%乙醇， 超聲30 min 后過濾， 精密吸取續(xù)濾液適量， 60% 乙醇稀釋約1 000 倍， 于320 nm 波長處測定吸光度， 代入“2.2.1.2” 項(xiàng)下回歸方程測得揮發(fā)油質(zhì)量濃度， 計(jì)算含油量及包合物收率、 含油率、 包合率， 公式如下。

含油量= （揮發(fā)油質(zhì)量濃度×溶液稀釋倍數(shù)×溶液體積） ／揮發(fā)油質(zhì)量×包合物質(zhì)量

包合物收率= [包合物實(shí)際質(zhì)量/（β-環(huán)糊精加入量＋投油量） ］ ×100%

含油率= （包合物含油量／包合物總質(zhì)量） ×100%

包合率= （包合物實(shí)際含油量／投油量） ×100%

2.2.3 綜合評價 包合率是評價包合效果的主要指標(biāo)， 包合率越高， 表明揮發(fā)油包合效果越好， 可有效改善揮發(fā)油穩(wěn)定性， 有利于制劑穩(wěn)定， 故將其權(quán)重系數(shù)確定為0.6[8］； 包合物收率在實(shí)際生產(chǎn)中具有重要意義， 但輔料加入過多時會增加成本， 故將其作為次要考察指標(biāo)， 權(quán)重系數(shù)確定為0.2； 含油率是評價包合物的重要指標(biāo)之一， 在控制制劑質(zhì)量方面有重要意義， 故將其權(quán)重系數(shù)確定為0.2[9-11］， 綜合評分=包合率×0.6 ＋包合物收率×0.2＋含油率×0.2。

2.3 包合物制備

2.3.1 包合材料

2.3.1.1 β-環(huán)糊精包合物[12］稱取β-環(huán)糊精2 g，置于100 mL 錐形瓶中， 加入40 mL 蒸餾水， 加熱溶解， 制備飽和水溶液[13］， 轉(zhuǎn)移至恒溫磁力攪拌器中， 攪拌下逐滴加入0.5 mL 揮發(fā)油（等量無水乙醇溶解）， 轉(zhuǎn)速300 r／min， 溫度40 ℃， 包合時間2 h， 待其冷卻至室溫后， 于4 ℃冰箱中冷藏24 h， 布氏漏斗抽濾， 依次用10 mL 蒸餾水、 無水乙醇（約30 mL， 10 mL／次） 洗滌， 置于45 ℃烘箱中干燥4 h， 即得。

2.3.1.2 羥丙基-β-環(huán)糊精包合物 稱取羥丙基-β-環(huán)糊精2 g， 置于100 mL 錐形瓶中， 加入40 mL蒸餾水， 加熱溶解， 制備飽和水溶液， 轉(zhuǎn)移至恒溫磁力攪拌器中， 攪拌下逐滴加入0.5 mL 揮發(fā)油（等 量 無 水 乙 醇 溶 解）， 轉(zhuǎn) 速300 r／min， 溫 度40 ℃， 包合時間2 h， 待其冷卻至室溫后， 分次加入10 mL 石油醚搖勻， 5 000 r／min 離心10 min，移去上層液體， 除去未包合的揮發(fā)油， 下層液體冷凍干燥， 即得。

2.3.1.3 包合效果比較 精密稱取2 種包合物各約0.5 g， 按“2.2” 項(xiàng)下方法測定含油量， 計(jì)算包合物收率、 包合率、 含油率， 結(jié)果見表1。 由表可知， 以β-環(huán)糊精為包合材料時綜合評分較高，其包合率、 含油率均高于羥丙基-β-環(huán)糊精， 其原因可能是后處理方式不同所致； 由于羥丙基-β-環(huán)糊精水溶性很好， 在與β-環(huán)糊精相同的處理方式（即于4 ℃冰箱中冷藏24 h） 下并未出現(xiàn)包合物與溶液分層的現(xiàn)象， 故無法進(jìn)行抽濾， 而采用冷凍干燥方式制備， 但該方法耗時長， 生產(chǎn)成本較高， 綜合考慮， 選擇β-環(huán)糊精作為包合材料。

表1 不同包合材料包合效果比較Tab.1 Comparison of inclusion effects of different inclusion materials

2.3.2 制備方法[14］

2.3.2.1 磁力攪拌法 同“2.3.1.1” 項(xiàng)。

2.3.2.2 高速分散法 稱取β-環(huán)糊精2 g， 置于100 mL 錐形瓶中， 加入40 mL 蒸餾水， 加熱溶解，制備飽和水溶液， 轉(zhuǎn)移至40 ℃高速分散儀中， 逐滴加入0.5 mL 揮發(fā)油（等量無水乙醇溶解）， 在相應(yīng)溫度下高速分散后， 取出冷卻至室溫， 余下步驟同“2.3.1.1” 項(xiàng)。

2.3.2.3 超聲法 稱取β-環(huán)糊精2 g， 置于100 mL錐形瓶中， 加入40 mL 蒸餾水， 加熱溶解，制備飽和水溶液， 轉(zhuǎn)移至40 ℃超聲儀中， 逐滴加入0.5 mL 揮發(fā)油（等量無水乙醇溶解）， 40 ℃下超聲1 h 后， 取出冷卻至室溫， 余下步驟同“2.3.1.1” 項(xiàng)。

2.3.2.4 研磨法 稱取β-環(huán)糊精2 g， 置于研缽中， 加入40 mL 蒸餾水， 逐滴加入0.5 mL 揮發(fā)油（等量無水乙醇溶解）， 研磨40 min 后轉(zhuǎn)移至錐形瓶中， 余下步驟同“2.3.1.1” 項(xiàng)。

2.3.2.5 包合效果比較 精密稱取4 種包合物各約0.5 g， 按“2.2” 項(xiàng)下方法測定含油量， 計(jì)算包合物收率、 包合率、 含油率， 結(jié)果見表2。 由表可知， 磁力攪拌法、 研磨法所得包合物收率較高，而高速分散法、 超聲法較低， 其原因可能是包合物在洗滌過程中部分流失， 導(dǎo)致粘于器壁內(nèi)部者未能收集而出現(xiàn)誤差； 高速分散法所得包合率、 含油率最高， 其他3 種方法相差不大， 綜合考慮， 選擇高速分散法作為包合方法。

表2 不同包合方法包合效果比較Tab.2 Comparison of inclusion effects of different inclusion methods

2.3.3 工藝優(yōu)化 通過預(yù)實(shí)驗(yàn)及查閱文獻(xiàn)[15-18］， 選擇揮發(fā)油與β-環(huán)糊精比例（A）、 包合溫度（B）、 分散時間（C） 作為影響因素， 包合物收率、 包合率、 含油率作為評價指標(biāo)， 正交試驗(yàn)優(yōu)化制備工藝。 因素水平見表3， 結(jié)果見表4， 方差分析見表5。

表3 因素水平Tab.3 Factors and levels

表4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.4 Design and results of tests

表5 方差分析Tab.5 Analysis of variance

表4 顯示， 各因素影響程度依次為B＞C＞A；表5 顯示， 因素B、 C 有顯著影響（P＜0.05）。 由此確定， 最優(yōu)工藝為A2B2C1， 即揮發(fā)油與β-環(huán)糊精比例1 ∶10， 包合溫度50 ℃， 分散時間5 min。

然后， 制備3 批包合物， 按上述優(yōu)化工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)， 結(jié)果見表6， 可知該工藝穩(wěn)定可行。

表6 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Tab.6 Results of verification tests （n=3）

2.4 包合物質(zhì)量評價

2.4.1 顯微鏡法 取β-環(huán)糊精、 高速分散后的β-環(huán)糊精、 包合物少許裝片， 置于載玻片上， 顯微鏡觀察其成像， 并拍攝照片， 結(jié)果見圖1。 由圖可知， β-環(huán)糊精、 高速分散后的β-環(huán)糊精均為無色透明立方體狀結(jié)晶， 表明外力作用并未使其形態(tài)發(fā)生改變； 包合物為黑色團(tuán)狀物質(zhì)， 表明發(fā)生了包合， 同時β-環(huán)糊精形態(tài)變化也表明有新物相形成。

2.4.2 紅外光譜法 取β-環(huán)糊精、 包合物、 物理混合物適量， 采用溴化鉀壓片法， 分辨率4 cm-1，掃描范圍4 000～400 cm-1， 進(jìn)行紅外光譜測定， 結(jié)果見圖2。 由圖可知， 物理混合物在1 766、 1 667、706 cm-1處有較強(qiáng)吸收峰， 而包合物中相應(yīng)波長處的吸收峰在包合后強(qiáng)度明顯減弱或消失， 峰形與β-環(huán)糊精較接近， 表明發(fā)生了包合。

圖1 樣品顯微圖Fig.1 Microscopic images for samples

2.4.3 差示掃描量熱法[19］稱取β-環(huán)糊精、 物理混合物、 包合物各8 mg， 置于鋁制坩堝中， 氮?dú)怏w積流量40 mL／min， 升溫速度10 ℃／min， 升溫范圍25～350 ℃， 結(jié)果見圖3。 由圖可知， 藥物分子與β-環(huán)糊精分子的包合是焓、 熵共驅(qū)過程， 吸熱峰消失、 峰型變寬、 峰轉(zhuǎn)移或新峰產(chǎn)生表明晶格、 烙點(diǎn)、 沸點(diǎn)、 升華點(diǎn)等改變[20］； β-環(huán)糊精在120、 220 ℃下有明顯特征峰， 前者是結(jié)晶水蒸發(fā)的吸熱峰， 而后者是β-環(huán)糊精的熔融分解峰[21］；物理混合物圖譜與β-環(huán)糊精基本相似， 但前者含有低沸點(diǎn)的揮發(fā)性成分， 其吸熱峰提前至106 ℃；包合物在220 ℃下未出現(xiàn)β-環(huán)糊精特征峰， 表明后者空腔內(nèi)結(jié)晶水已被揮發(fā)油置換出來， 生成了新物相， 而且吸收峰較平緩， 熱熵值減小， 可能發(fā)生了分子作用， 推測是由于包合效應(yīng)的存在而使得包合物熱穩(wěn)定性提高。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)比較了β-環(huán)糊精、 羥丙基-β-環(huán)糊精的包合效果， 發(fā)現(xiàn)兩者水溶性相差極大， 后處理步驟也有所不同， 其中前者所得包合物收率雖然略低，但包合率、 含油率、 綜合評分高于后者， 故選擇其作為包合材料。 然后， 比較了磁力攪拌法、 高速分散法、 超聲法、 研磨法的包合效果， 發(fā)現(xiàn)參數(shù)條件相同時， 超聲法、 磁力攪拌法、 研磨法有一部分揮發(fā)油會浮在液面上， 并未被包合進(jìn)去， 從而造成損失； 高速分散法未發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象， 而且操作簡便，時間短， 在一定程度上降低了生產(chǎn)成本， 有利于揮發(fā)油包合工業(yè)生產(chǎn)， 故選擇其作為制備方法。

圖2 樣品紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectra for samples

圖3 樣品差示掃描量熱圖譜Fig.3 Differential scanning calorimetry spectra for samples

在揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物的質(zhì)量評價中， 大部分文獻(xiàn)均采用經(jīng)典的《中國藥典》 方法， 即水蒸氣蒸餾法進(jìn)行提取測定， 但由于都梁方中川芎揮發(fā)油的密度與水接近， 極易發(fā)生乳化， 給測定造成了一定困難， 而且該方法測定時間較長， 讀數(shù)小，誤差較大。 當(dāng)體系達(dá)到動態(tài)平衡時， 解吸附的逆向反應(yīng)也將達(dá)到平衡， 不能徹底進(jìn)行； 有些解吸附成分溶于沸水中， 造成包合物中揮發(fā)油提取不完全，影響其包合率測定[22］， 故本實(shí)驗(yàn)采用紫外分光光度法， 能快速、 準(zhǔn)確地對都梁方中揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物進(jìn)行含油量測定。

另外， 本實(shí)驗(yàn)以乙醇為提取溶劑， 浸泡后超聲提取包合物中揮發(fā)油， 再考察了不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對提取效果的影響， 發(fā)現(xiàn)60% 時最理想， 故選擇60%乙醇作為提取溶劑。