徐高峰,鮑 鋼,白曉斌,祁 磊,謝萬(wàn)福,李瑞春

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科,西安 710061;*通訊作者,E-mail:lrckhz@163.com)

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤,具有易局部播散、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)[1]。盡管關(guān)于腦膠質(zhì)瘤治療技術(shù)有了較大進(jìn)步,患者預(yù)后有了較大改善,但腦膠質(zhì)瘤的治療仍缺乏突破性進(jìn)展。探索腦膠質(zhì)瘤的新型診療技術(shù)是神經(jīng)科學(xué)界亟待解決的研究熱點(diǎn)。

新疆甘草根作為治療胃潰瘍、支氣管哮喘和炎癥的傳統(tǒng)藥物已在世界范圍內(nèi)使用數(shù)千年,甘草查爾酮A(licochalcone A,Lico A)是其主要提取物[2]。Lico A具有多種藥理學(xué)作用,如利什曼原蟲(chóng)[3]和瘧疾[4]的抗寄生蟲(chóng)活性、抗炎活性[5]和抗肥胖活性[6],重要的是近幾年發(fā)現(xiàn)其有抗腫瘤作用[7-9]。LicoA可誘導(dǎo)胃癌、宮頸癌和口腔癌的細(xì)胞凋亡[7,9,10];值得我們關(guān)注的是,有文獻(xiàn)報(bào)道,Lico A具有誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的作用[11],但是其機(jī)制尚未闡明。

錯(cuò)誤蛋白或未折疊在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器)內(nèi)聚集,損傷其正常生理功能,稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)[12]。大量文獻(xiàn)表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)凋亡信號(hào)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。綜上,本研究擬用腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251,探討甘草查爾酮A促腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制是否通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑及儀器

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gbico公司);甘草查爾酮A(Sigma公司);小鼠抗人Chop抗體、兔抗人GRP78抗體、兔抗人cleaved caspase-12抗體、兔抗人β-actin抗體(Abcam公司);生物素標(biāo)記的山羊抗免(二抗)購(gòu)自公司;生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠(二抗)購(gòu)自Proteintech公司;胰酶、青霉素和鏈霉素混合液、ABC定量試劑盒、Hoechst33258染色液和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒均購(gòu)自碧云天公司。

1.2 細(xì)胞來(lái)源與培養(yǎng)

U251為腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株系,購(gòu)自賽業(yè)生物科技有限公司。人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251培養(yǎng)液中,胎牛血清 ∶DMEM為1 ∶9,另外每100 ml培養(yǎng)液加入青霉素和鏈霉素混合液,在細(xì)胞培養(yǎng)箱(5% CO2、37 ℃)中隔天傳代培養(yǎng)。

1.3 CCK-8法檢測(cè)Lico A對(duì)U251細(xì)胞增殖的抑制作用

收集對(duì)數(shù)期U251生長(zhǎng)細(xì)胞,接種于96孔板,設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,用含15,30,45 μmol/L的Lico A(即為L(zhǎng)ico A低濃度組、Lico A中濃度組,Lico A高濃度組)處理U251細(xì)胞；另設(shè)control組，細(xì)胞用含10%的血清培養(yǎng)液處理。處理48 h,倒掉培養(yǎng)液,并用PBS清洗一遍,輕柔拍干,每孔加入20 μl的5 mg/ml MTT溶液,繼續(xù)孵育4 h,棄去孔內(nèi)液體,加入150 μl DMSO,震蕩10 min,用酶標(biāo)儀于490 nm處測(cè)定各孔吸光度值,計(jì)算細(xì)胞成活率。

1.4 Hoechst33258染色檢測(cè)U251細(xì)胞凋亡情況

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞按1×105個(gè)/ml接種于6孔板中,置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜,按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)照組(即control組,用含10%的血清培養(yǎng)液處理U251細(xì)胞)和Lico A低濃度組、Lico A中濃度組,Lico A高濃度組(分別用15,30,45 μmol/L的Lico A處理U251細(xì)胞),均處理48 h。棄去培養(yǎng)液,用PBS進(jìn)行洗滌細(xì)胞,輕拍干細(xì)胞培養(yǎng)板,加入4%多聚甲醛固定后用PBS洗滌細(xì)胞2次;再加入150 μl Hoechst33258染液,避光染色10 min,PBS洗滌細(xì)胞,在熒光顯微鏡下觀察U251細(xì)胞形態(tài)及熒光強(qiáng)度。

1.5 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)

為了觀察Lico A處理對(duì)U251細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,設(shè)置了control組(用含10%的血清培養(yǎng)液處理U251細(xì)胞)、Lico A低濃度組、Lico A中濃度組、Lico A高濃度組(分別含15,30和45 μmol/L的Lico A),待處理U251細(xì)胞48 h后,提取總蛋白。將經(jīng)過(guò)蛋白定量后的蛋白取出,在每泳道加入15 μl的蛋白溶解物,根據(jù)蛋白分子量進(jìn)行8%-12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上并用5%脫脂牛奶在Tris-緩沖鹽水與吐溫(TBST)在室溫下孵育2 h。膜在4 ℃下分別與Bax、Bcl-2、GRP78、Chop或cleaved caspase-12抗體和5%脫脂牛奶(濃度均為1 ∶1 000)過(guò)夜孵育,然后與二抗和5%脫脂牛奶(濃度為1 ∶5 000)孵育2 h。最后通過(guò)使用增強(qiáng)的ECL化學(xué)發(fā)光,在顯影儀(Biorad)上顯影。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理,所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,再行單因素方差分析組間差異,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 甘草查爾酮A對(duì)U251細(xì)胞增殖的抑制作用

結(jié)果顯示,甘草查爾酮A處理U251細(xì)胞48 h后,15,30,45 μmol/L的甘草查爾酮A能濃度依賴性地降低U251細(xì)胞活力,與control組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖1),表明甘草查爾酮A能誘導(dǎo)U251細(xì)胞損傷。

2.2 甘草查爾酮A誘導(dǎo)U251細(xì)胞發(fā)生凋亡形態(tài)學(xué)改變

甘草查爾酮A處理U251細(xì)胞48 h后,與contol組比較,15,30和45 μmol/L的甘草查爾酮A可增加Hoechst33258染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目(見(jiàn)圖2),表明甘草查爾酮A能誘導(dǎo)U251細(xì)胞發(fā)生凋亡形態(tài)學(xué)改變。

與control組比較,*P<0.05,***P<0.001圖1 甘草查爾酮A對(duì)U251細(xì)胞活力的影響Figure 1 Effect of licochalcone A on cell viability of glioma cells U251

2.3 甘草查爾酮A誘導(dǎo)U251細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)增加和Bcl-2蛋白表達(dá)降低

與control組比較,15,30和45 μmol/L的甘草查爾酮A可濃度依賴性地上調(diào)U251細(xì)胞促凋亡Bax蛋白的表達(dá),并下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表達(dá),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖3),表明甘草查爾酮A能誘導(dǎo)U251細(xì)胞凋亡。

2.4 甘草查爾酮A誘導(dǎo)U251細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、Chop和cleaved caspase-12蛋白表達(dá)的增加

與control組比較,15,30和45 μmol/L的甘草查爾酮A可不同程度地上調(diào)U251細(xì)胞Chop、GRP78和cleaved caspase-12蛋白的表達(dá),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖4),表明甘草查爾酮A通過(guò)誘導(dǎo)U251細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

白色三角形標(biāo)注所示為發(fā)生核固縮或破裂的細(xì)胞(透亮)A.control組; B.15 μmol/L Lico A組; C.30 μmol/L Lico A組; D.45 μmol/L Lico A組圖2 Hoechst33258染色法檢測(cè)U251細(xì)胞凋亡形態(tài)變化 (×200)Figure 2 Morphological changes of U251 cells apoptosis by Hoechst33258 staining (×200)

3 討論

根據(jù)世界衛(wèi)生組織分類(lèi),多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤是一種Ⅳ級(jí)星形細(xì)胞瘤,5年生存率約5%,最具惡性的原發(fā)性腦腫瘤[1],嚴(yán)重危害著患者及其家屬的生活。目前它的治療主要以手術(shù)、放療和化療手段為主,沒(méi)有很大的進(jìn)展,一種新型藥物的開(kāi)發(fā)對(duì)腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤顯得尤為迫切。

甘草查爾酮A作為新疆甘草的提取物,已被證實(shí)具有多種藥理學(xué)作用,其中包括抗腫瘤作用[7-9]。甘草查爾酮A對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡作用[11]已得到證實(shí),但其具體的機(jī)制尚未闡明。故本研究擬探討甘草查爾酮A促腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與凋亡有著密切的關(guān)系,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過(guò)度就會(huì)干擾正常細(xì)胞的生理功能,從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化或凋亡[12,14]。因此,本研究提出了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是甘草查爾酮A促腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制這一假說(shuō)。本研究運(yùn)用腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株系U251細(xì)胞,探討甘草查爾酮A誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是否由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促發(fā)。

與control組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001圖3 Western blot檢測(cè)甘草查爾酮A對(duì)U251細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 3 Effect of licochalcone A on the expression of apoptosis-related proteins in U251 cells by Western blot

首先,本研究為了明確甘草查爾酮A對(duì)U251細(xì)胞活力的抑制作用,用MTT法檢測(cè)U251細(xì)胞活力,發(fā)現(xiàn)15，30和45 μmol/L的甘草查爾酮A能濃度依賴性地抑制U251細(xì)胞的增殖,表明甘草查爾酮可誘導(dǎo)U251細(xì)胞損傷。接著本研究分別用Hoechst33258染色法和Western blotting檢測(cè)了不同濃度甘草查爾酮A處理后,U251細(xì)胞的凋亡情況和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),15,30和45 μmol/L的甘草查爾酮A不僅可明顯增加Hoechst33258染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目,且可濃度依賴性地上調(diào)U251細(xì)胞促凋亡蛋白Bax(3B)并下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2(3C)的表達(dá),表明甘草查爾酮A能誘導(dǎo)U251細(xì)胞凋亡,該結(jié)果與多個(gè)實(shí)驗(yàn)室所做結(jié)果一致[15,16]。

最后,我們探討了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否是甘草查爾酮A促U251細(xì)胞凋亡作用的重要機(jī)制。

眾所周知,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一種多功能細(xì)胞器,負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、折疊和組裝。在外部刺激下,過(guò)量錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)積聚并觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)平衡被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激擾亂并且不能通過(guò)細(xì)胞的自我調(diào)節(jié)能力恢復(fù)時(shí),就會(huì)發(fā)生細(xì)胞凋亡或程序性細(xì)胞死亡[17]。幾種途徑被證明與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān),例如轉(zhuǎn)錄因子Chop,唯一一種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的caspase成員cleaved caspase-12,GRP78,JNK途徑等。本研究用Western blot檢測(cè)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白(Chop、GRP78和cleaved caspase-12)的表達(dá),發(fā)現(xiàn)15,30和45 μmol/L甘草查爾酮A處理48 h后,可不同程度地上調(diào)U251細(xì)胞Chop、GRP78和cleaved caspase-12蛋白的表達(dá),甘草查爾酮A誘導(dǎo)U251細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,長(zhǎng)期處于此狀態(tài)下,可激活PERK/ATF4/CHOP、IRE1/JNK、Caspase等信號(hào)通路,從而介導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[18]。綜上所述,表明甘草查爾酮A可通過(guò)誘導(dǎo)U251細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

本研究的開(kāi)展豐富了甘草查爾酮A促腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的研究機(jī)制,為開(kāi)發(fā)甘草查爾酮A治療腦膠質(zhì)瘤提供了新的理論依據(jù),具有重要的意義。