盧曉林,曲婷麗,許晉芳,趙正保

(山西醫(yī)科大學藥學院藥物化學教研室,太原 030001;*通訊作者,E-mail:zhengbao-z@sxmu.edu.cn)

中藥材是我國傳統(tǒng)醫(yī)學的重要組成,它不僅維護了我國人民的身體健康,還為世界醫(yī)學的發(fā)展提供了重要支持。甘草(Glycyrrhizauralensis Fisch.)又叫甜草、國老、甜根子等。豆科、甘草屬,國內主要分布在新疆、內蒙古、寧夏、甘肅、山西朔州[1],春、秋二季采收,根及根莖入藥。其性甘,味平,歸心、肺、脾、胃經,中醫(yī)上臨床主要用于補脾益氣,清熱解毒,祛痰止咳,消炎[2,3]止痛,還可調和諸藥,使用廣泛[4]。

但是,近年來,隨著我國經濟發(fā)展和人口增長,中藥材的野外生長環(huán)境遭到了嚴重破壞和污染,由此引起藥材中重金屬含量增多和有機氯農藥殘留日益嚴重,生長范圍廣泛的甘草也不可避免。盡管人工種植可以彌補部分市場需求,可是培育藥材與野生藥材質量差異明顯[5-7]。因此,測定甘草中的重金屬含量以及有機氯農藥殘留量是非常必要的,不僅可以指導臨床安全用藥,還可以監(jiān)測生長地的環(huán)境污染程度,指導人工培育合理使用農藥[8]。本文采用靈敏度和精密度較好的電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)來測定重金屬含量[9-11],氣相色譜法測定有機氯農藥殘留的含量。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

電感耦合等離子體質譜儀(Thermo,型號iCAPQ),高壓消解罐,電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司,AL104型),旋轉蒸發(fā)儀(IKA HB10),注復式脫色搖床(TS.B-108),低速臺式離心機(TDL-5-A),超聲波清洗器(SB-5200DTDM),精密天平(TE612-L,ZA3052H),氣相色譜儀(日本島津公司,GC-2010),電熱恒溫鼓風干燥箱(上海一橫科技有限公司,DHG-9070型),傾斜式高速萬能粉碎機(北京中興偉業(yè)儀器有限公司,FW-400A)。

1.2 試劑

石油醚(60-90 ℃)(色譜純),丙酮(分析純),二氯甲烷(色譜純),濃硫酸(分析純),無水甲醇(分析純,以上試劑均購自天津市大茂化學試劑廠);無水硫酸鈉(分析純),氯化鈉(分析純,以上試劑均購自天津市風船化學試劑科技有限公司)。

銅(Cu)對照品溶液(GSB04-1725-2004),砷(As)對照品溶液(GSB04-1714-2004),鎘(Cd)對照品溶液(GSB04-1721-2004),汞(Hg)對照品溶液(GSB04-1729-2004),鉛(Pb)對照品溶液(GSB04-1742-2004),質量濃度均為1 000 μg/L;鍺(Ge)、銦(In)、鉍(Bi)混合內標儲備液(GSB04-2826-2011),質量濃度均為10 μg/ml。以上對照品購自國家標準物質研究中心。硝酸(優(yōu)級純),去離子水。

有機氯對照品:六六六(BHC)為α-BHC(10 mg,批號:0911942),β-BHC(10 mg,批號:12354),γ-BHC(10 mg,批號:23077)和δ-BHC(10 mg,批號:081214KC);滴滴涕(DDT)為p,p′-DDE(10 mg,批號:25867),p,p′-DDD(250 mg,批號:26602),p,p′-DDT(10 mg,批號:041014MT)和o,p′-DDT(10 mg,批號:070912DT);五氯硝基苯(PCNB,10 mg,批號:09424KS)均購自Accustandard公司;純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司生產)。

1.3 藥材樣品

甘草采集于山西省朔州市不同地方(編號:S1-S10),由山西醫(yī)科大學藥學院中藥學教研室白云娥副教授鑒定。

2 方法與結果

2.1 重金屬含量測定

2.1.1 ICP-MS工作條件 射頻功率1.15 kW;采樣深度65 mm;輔助氣流速1.0 L/min;冷卻氣體流量13.0 L/min;環(huán)境溫度25 ℃;自動等離子體觀測。

2.1.2 測定方法 測定選取的同位素為63Cu、75As、114Cd、202Hg和208Pb,其中63Cu、75As以72Ge作為內標,114Cd以115In作為內標,202Hg、208Pb以209Bi作為內標,并根據(jù)不同儀器的要求選用適宜校正方對測定的元素進行校正。

儀器的內標進樣管在儀器分析工作過程中始終插入內標溶液中,依次將儀器的樣品管插入各個濃度的標準品溶液中進行測定(濃度依次遞增),以測量值為縱坐標,濃度為橫坐標,繪制標準曲線。

2.1.3 溶液的制備 對照品貯備溶液的制備:分別精密量取Pb、As、Cd、Hg、Cu單元素標準溶液適量,用10%硝酸溶液配制成每1 ml分別含Pb、As、Cd、Hg、Cu的量為1.0 μg、0.5 μg、1.0 μg、1.0 μg、10 μg的貯備液,備用。

混合對照品溶液的制備:精密量取Pb、As、Cd、Cu對照品貯備液適量,用10%硝酸溶液配制成每1 ml分別含Pb、As 0,1,5,10,20 ng;含Cd 0,0.5,2.5,5,10 ng;含Cu 0,50,100,200,500 ng的系列濃度混合溶液。另精密量取Hg對照品貯備液適量,用10%硝酸溶液配制成每1 ml分別含Hg 0,0.2,0.5,1,2,5 ng的溶液,Hg對照品溶液應臨用現(xiàn)配。

內標溶液的制備:精密量取Ge、In、Bi標準溶液適量,用5%硝酸溶液配制成每1 ml各含1 μg的混合溶液,備用。

供試品溶液的制備:將藥材用自來水沖洗干凈后,再用去離子水漂洗多次,自然晾干后置于烘箱中,60 ℃烘至恒重,取出后粉碎。取供試品約0.5 g,精密稱定,置高壓消解罐中,加硝酸5 ml,靜置過夜,旋緊不銹鋼外套,放入恒溫干燥箱于150 ℃消解4 h,取出,放冷,緩慢旋松不銹鋼外套,將消解液置于50 ml容量瓶中,用少量水洗滌消解罐,洗液合并于量瓶中,用蒸餾水稀釋至刻度,搖勻,待測。

空白對照溶液:往高壓消解罐中加硝酸5 ml,靜置過夜,旋緊不銹鋼外套,放入恒溫干燥箱于150 ℃消解4 h,取出,放冷,緩慢旋松不銹鋼外套,將消解液置于50 ml容量瓶中,用少量水洗滌消解罐,洗液合并于量瓶中,用蒸餾水稀釋至刻度,搖勻,待測。

2.1.4 標準曲線的繪制 量取適量“2.1.3”項下方法配制的Pb、As、Cd、Cu系列濃度混合對照品溶液和系列濃度的汞對照品溶液,采用電感耦合等離子體質譜法,按照2.1.2項下方法測定,得Pb、As、Cd、Hg、Cu 5種重金屬元素的線性方程(見表1)。

表1 5種重金屬元素的線性方程

Table 1 Linear equations of five heavy metal elements

元素線性方程 R2線性范圍(ng/ml)Pby=62082.3194x+25418.04650.99880-20Asy=663.0321x+404.19730.99930-20Cdy=3569.0946x+100.00070.99880-10Hgy=297.3857x2+8776.0062x-56.25500.99850-5 Cuy=8673.7194x+968.37310.9998 0-500

2.1.5 精密度試驗 取“2.1.3”項下混合對照品適量,按照“2.1.1”項下條件對每種重金屬元素平行測定6次,Pb、As、Cd、Hg、Cu相應測定值的RSD依次為5.2%,7.7%,8.2%,6.3%,4.1%,精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 精密稱取“2.1.3”項下供試品(S1)適量,分別于室溫下放置6,12,24,48,15,30 d后按照“2.1.1”測定,Pb、As、Cd、Hg、Cu的響應值的RSD依次為4.7%,8.0%,7.3%,5.8%,3.5%,結果顯示供試品溶液在室溫下30 d內基本穩(wěn)定。

2.1.7 重復性試驗 精密稱取編號S1的平行甘草藥材6份,按照“2.1.3”項下供試品溶液制備的方法消解處理樣品后,制作成相應的供試品測定,所得各元素測定值的RSD為4.9%,7.8%,7.9%,5.6%,4.0%,重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 從甘草中取已知含量的編號S1的藥材樣品9份,精密稱定,分別加入適量高、中、低質量的待測元素對照品溶液,按照按照“2.1.3”項下供試品溶液制備的方法處理、測定并計算加樣回收率,結果見表2。從表中可以看出銅、砷、鎘、汞、鉛的回收率滿足了痕量分析加樣回收率的要求,加樣回收率良好。

表2 重金屬含量測定中甘草加樣回收率試驗

Table 2 Recovery test of licorice in heavy metal content determination

金屬元素本底(μg/L)加標值(μg/L)測定值(μg/L)123回收率 (%) Cu143.27125.00166.256160.977-70.8-91.950.00180.228187.091184.12773.9-87.5100.00226.455239.488224.79381.5-96.2As3.2101.004.1874.1193.77290.9-97.72.005.4175.3445.248101.9-110.34.007.4548.1787.811106.1-124.2Cd0.3740.300.7430.7360.679101.5-122.90.601.0351.1081.078110.2-122.31.001.5321.6171.564115.8-124.9Hg0.3080.300.6640.6280.59294.6-118.60.600.9250.9791.008102.9-116.71.001.3291.3371.340102.1-103.2Pb3.6921.004.4684.542-77.6-85 2.005.0515.4705.54568.0-92.74.006.8157.0587.04878.1-84.2

“-”表示誤差太大,已刪除

2.1.9 甘草中5種重金屬元素的含量測定 從10個編號的甘草藥材中各取約0.5 g,精密稱定,按照“2.1.3”項下供試品溶液制備的方法處理并進行測定,每批樣品平行測定2次(結果見表3)?！吨袊幍洹?2015版)中重金屬元素限量規(guī)定:Pb≤5 mg/kg;Cd≤0.3 mg/kg;As≤2 mg/kg;Hg≤0.2 mg/kg;Cu≤20 mg/kg。從表3中可以看出,測定的甘草中5種重金屬元素實際測得結果均低于限量規(guī)定,約為規(guī)定值的1/16-1/2,這可能與藥材種類和當?shù)厣L環(huán)境等有關。

表3 甘草中5種重金屬含量

Table 3 Content determination of five heavy metals in licorice

批號取樣量(g)63Cu75As111Cd202Hg208Pb平均(ng/ml)含量(mg/kg)平均(ng/ml)含量(mg/kg)平均(ng/ml)含量(mg/kg)平均(ng/ml)含量(mg/kg)平均(ng/ml)含量(mg/kg)S10.5025107.33510.6802.2290.2220.2740.0270.3380.0343.2650.325S20.5028107.28010.6682.2510.2240.2830.0280.3310.0332.9640.295S30.481195.1219.8861.9870.2070.2820.0290.2900.0303.2360.336S40.480294.2179.8102.0270.2110.2630.0270.2610.0272.9810.310S50.5023101.63310.1172.1560.2150.2850.0280.2800.0283.3040.329S60.5026105.19010.4652.1860.2170.2850.0280.2960.0293.2400.322S70.5024106.46510.5962.1880.2180.2740.0270.2830.0282.9600.295S80.5018102.87810.2511.9800.1970.2810.0280.2820.0282.9850.297S90.5016103.60910.3282.1580.2150.2800.0280.2790.0282.8760.287S100.5021102.02910.1601.9620.1950.2570.0260.2490.0252.8200.281

平均指對每個樣品中的5種重金屬分別平行測定兩次,取其兩次結果的平均值;含量指每千克甘草中重金屬的含量

2.2 有機氯農藥殘留含量測定

2.2.1 氣相色譜條件 固定液為(5%苯基)甲基聚硅氧烷的彈性石英毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm),63Ni-ECD電子捕獲檢測器。進樣口溫度設置為280 ℃,檢測器溫度設置為300 ℃,不分流進樣。程序升溫:初始溫度100 ℃,然后以1 min升溫10 ℃達到195 ℃,接著保持7 min升溫8 ℃達到250 ℃,在250 ℃維持2 min。定量方法:外標法。

2.2.2 溶液的制備 對照品貯備溶液的制備:精密稱取α-BHC、β-BHC、γ-BHC、δ-BHC、p,p′-DDE、p,p′-DDD、p,p′-DDT、o,p′-DDT、五氯硝基苯(PCNB)各對照品適量,用石油醚分別制成每1 ml約含5 μg的貯備液,備用。

混合對照品貯備溶液的制備:精密量取上述各對照品貯備液0.5 ml,置10 ml的容量瓶中,用石油醚稀釋至刻度,搖勻,即得。

混合對照品溶液的制備:精密量取0,0.04,0.2,0.4,2,4 ml的混合對照品貯備液,分別置10 ml的容量瓶中,用石油醚定容至刻度,即得到濃度分別約為0,1,5,10,50,100 μg/L的混合對照品溶液。

供試品溶液的制備:從甘草藥材中各取供試品適量,粉碎過三號篩,精密稱取2 g,置100 ml的具塞錐形瓶中,加水20 ml浸泡過夜,精密加丙酮40 ml,準確稱定,超聲處理30 min,冷卻后再稱定重量,用丙酮補足重量,再加氯化鈉約6 g,精密加二氯甲烷30 ml,準確稱定,超聲15 min,再稱定重量,用二氯甲烷補足重量,靜置,分層后將有機相迅速移入裝有適量無水硫酸鈉的100 ml具塞錐形瓶中,放置4 h。精密量取35 ml,于40 ℃水浴上減壓濃縮至近干,加少量石油醚重復操作至二氯甲烷及丙酮除凈,用石油醚溶解并轉移至10 ml具塞刻度離心管中,加石油醚精密稀釋至5 ml,小心加入硫酸1 ml,振搖1 min,離心(3 000 r/min,10 min),精密量取上清液2 ml,置具刻度的濃縮瓶中,將溶液40 ℃下(或用N2)旋轉蒸發(fā)濃縮至適量,精密稀釋至1 ml,即得。

空白溶液的制備:同“2.2.2”項下供試品溶液的制備,但是不加甘草供試品,考察供試品溶液處理中所用試劑對測定結果的干擾。

2.2.3 標準曲線的繪制 按“2.2.2”項下配制的混合對照品濃度,采用氣相色譜法測定,得α-BHC、β-BHC、γ-BHC、δ-BHC、p,p′-DDE、p,p′-DDD、p,p′-DDT、o,p′-DDT、PCNB的線性方程(見表4)。

2.2.4 精密度試驗 精密吸取各濃度混合對照品溶液1 μl,連續(xù)進樣5次,測定峰面積,計算RSD值為0-1.3%(小于2.0%),精密度良好。

2.2.5 加樣回收率試驗 從甘草中取已知含量的藥材(編號S1)樣品3份,精密稱取2 g,分別加入高、中、低質量的9種有機氯農藥殘留混合對照品溶液,按“2.2.2”項下供試品溶液的制備方法處理、測定并計算加樣回收率,結果見表5。從表中可以看出,9種有機氯的回收率滿足了痕量分析加樣回收率的要求,加樣回收率良好。

表4 9種有機氯成分的線性方程

Table 4 Linear equations of nine organochlorines

有機氯成分線性方程 R2線性范圍(μg/L)α-BHCy=14605.3875x+34679.39850.99770-250.0β-BHCy=6237.2361x+71557.92450.99060-255.0γ-BHCy=13252.2331x+23261.93050.99670-250.0δ-BHCy=12307.0932x+32965.24570.99710-252.5p,p′-DDEy=12950.8216x-2504.54130.99530-252.5p,p′-DDDy=8006.7381x+19025.98140.99750-257.5p,p′-DDTy=9941.8453x+6179.55090.99800-250.0o,p′-DDTy=8340.2613x+11504.83330.99630-252.5PCNBy=15103.6699x+90388.86240.99660-252.5

2.2.6 甘草中9種有機氯農藥殘留的含量測定 從前面10個編號的甘草藥材中取供試品適量,精密稱取2 g,按“2.2.2”項下供試品溶液的制備方法處理并測定,每批樣品平行測定2次,結果見表6?！吨袊幍洹?2015版)中有機氯農藥殘留限量規(guī)定:含總六六六不得過0.2 mg/kg;總滴滴涕不得過0.2 mg/kg;五氯硝基苯不得過0.2 mg/kg。從表6中可以看出,9種有機氯農藥殘留量實際測得量遠遠低于限量要求。

表5 有機氯測定中甘草加樣回收率試驗

Table 5 Recovery test of licorice in the determination of organochlorines

成分 取樣量(g)本底值(ng)加標值(ng)平均測定值(ng/L)測得量(ng)回收率(%)α-BHC2.005026.5750.08.51×103 85.05117.02.004026.56100.014.30×103143.02116.52.005326.58150.017.09×103170.9396.2β-BHC2.00505.3651.05.99×10359.88107.02.00405.36102.011.59×103115.88108.42.00535.36153.014.10×103140.9588.6γ-BHC2.00502.5950.05.51×10355.12105.12.00402.59100.011.81×103118.08115.52.00532.59150.015.10×103150.9698.9δ-BHC2.00501.8350.56.07×10360.73116.62.00401.83101.012.78×103127.78124.72.00531.83151.516.03×103160.26104.6p,p′-DDE2.00502.5250.55.56×10355.62105.12.00402.52101.011.39×103113.86110.22.00532.52151.514.31×103143.0992.8p,p′-DDD2.0050051.55.38×10353.80104.52.00400103.012.40×103124.04120.42.00530154.515.20×103151.9898.4p,p′-DDT2.00504.7050.05.92×10359.22109.12.00404.69100.013.11×103131.07126.42.00534.70150.015.62×103152.0098.2o,p′-DDT2.0050050.55.33×10353.30105.52.00400101.012.37×103123.70122.22.00530151.514.76×103147.5897.4PCNB2.005034.4750.57.92×10379.1688.52.004034.45101.012.72×103127.1891.82.005334.48151.515.05×103150.5476.6

表6 甘草中9種有機氯農藥殘留的含量

Table 6 Contents of 9 organochlorine pesticide residues in licorice

批號取樣量(g)α-BHCβ-BHC(μg/L)γ-BHC(μg/L)δ-BHC(μg/L)平均(μg/L)含量(μg/kg)平均(μg/L)含量(μg/kg)平均(μg/L)含量(μg/kg)平均(μg/L)含量(μg/kg)總六六六量(μg/kg)S1 2.00954.73211.7740.9902.4630.4651.1570.6801.69217.086S2 2.00885.32513.3131.0742.6730.5191.292--17.278S3 2.01663.3518.3090.7321.8150.3520.873--10.997S4 2.00452.5366.3260.4711.1750.4611.150--8.651S5 2.00412.7186.7810.5401.3470.2930.731--8.859S6 2.00353.5738.9170.8872.2140.4101.023--12.154S7 2.00893.3028.2180.5661.4090.4261.060--10.687S8 2.00303.4488.6070.5831.4550.5061.263--11.326S9 2.00801.9274.7980.3070.766----5.564S102.00902.2505.6000.3640.906----6.506

續(xù)表6 甘草中9種有機氯農藥殘留的含量

Table 6 Contents of 9 organochlorine pesticide residues in licorice

批號取樣量(g)p,p′-DDEp,p′-DDDp,p′-DDTo,p′-DDT平均(μg/L)含量(μg/kg)平均(μg/L)含量(μg/kg)平均(μg/L)含量(μg/kg)平均(μg/L)含量(μg/kg)總滴滴涕量(μg/kg)PCNB平均(μg/L)含量(μg/kg)S1 2.0095----0.5681.413--1.4136.31915.723S2 2.00880.5051.257--0.9412.342--3.5996.90717.192S3 2.0166----0.6081.508--1.5084.77511.839S4 2.0045------1.1352.8312.8313.8949.713S5 2.0041---------3.8779.673S6 2.00350.5271.315------1.3154.99312.461S7 2.00890.5411.347------1.3474.48611.165S8 2.00300.6231.555--0.6101.523--3.0784.84111.186S9 2.0080---------2.9117.249S102.0090---------3.3248.273

“-”表示未檢出;平均指對每個樣品中的9種有機氯分別平行測定兩次,取其兩次結果的平均值;含量指每千克甘草中每種有機氯殘留的含量

3 討論

本文所用甘草中Cu、As、Cd、Hg、Pb 5種重金屬含量范圍依次為Cu 9.810-10.680 mg/kg,As 0.195-0.224 mg/kg,Cd 0.026-0.029 mg/kg,Hg 0.025-0.034 mg/kg,Pb 0.281-0.336 mg/kg,9種有機氯農藥殘留的含量中總六六六的含量范圍為5.564-17.278 μg/kg,總滴滴涕含量范圍為0-3.599 μg/kg,五氯硝基苯(PCNB)的含量范圍為7.249-17.192 μg/kg。

5種重金屬元素和9種有機氯農藥殘留的含量均符合《中國藥典》(2015版)限量要求。雖然在朔州采集的甘草在這兩項上符合安全使用的要求,但全國范圍內的中藥材重金屬污染問題仍然嚴峻[12],有機氯農藥殘留的污染也會隨著人工培育藥材變得愈演愈烈,考慮到重金屬的長期蓄積效應[13,14]和有機氯農藥殘留的急性毒性。建議提高相應的限量標準,對中藥材質量嚴格把關,進而保證患者用藥安全、有效。

本文采用的ICP-MS和GC檢測方法精密度高,重復性好,簡便快捷,準確可靠,非常適用于重金屬和有機氯農藥殘留的測定。