孫宗斌 王戰(zhàn)會 關(guān)紹康 鄭秋霞 陳虎 朱世杰 段廷賀 張兵兵 劉少朋 許凱

隨著生命科學(xué)的蓬勃發(fā)展,生物醫(yī)用材料被科研工作者廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)研究中,一些生物醫(yī)用材料已經(jīng)應(yīng)用于胃腸外科領(lǐng)域,通過在腸道植入支架支撐并擴張腸道解決腸道狹窄問題。Mg-Zn-Y-Nd合金作為一種新型鎂合金材料,其具有良好的生物學(xué)降解性及生物學(xué)安全性［1］。而且,先前研究已經(jīng)證實PLLA材料涂覆合金表面能夠明顯延緩合金的降解率［2］。然而,具有良好降解性能的PLLA/Mg-Zn-Y-Nd鎂合金腸道支架在腸道內(nèi)安全性如何尚未見詳細(xì)報道。本實驗以此探究PLLA/Mg-Zn-Y-Nd鎂合金支架在兔腸道內(nèi)的安全性?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源 選取6月齡健康新西蘭大白兔36只,體質(zhì)量2.0～2.5 kg,健康狀況良好。隨機分為空白對照組、裸支架組、PLLA涂層組,各12只。可降解Mg-Zn-Y-Nd合金材料由鄭州大學(xué)河南省先進鎂合金重點實驗室提供,采用單絲一體化整體性編織技術(shù)制備支架,經(jīng)浸涂提拉法涂覆PLLA,制備出裸露Mg-Zn-Y-Nd合金支架12枚,PLLA/Mg-Zn-Y-Nd 支架12枚。支架大小20.0 mm ×10.0 mm,纖維直徑0.30 mm。

1.2 實驗方法 36只大白兔植入支架時經(jīng)肌內(nèi)注射戊巴比妥麻醉,麻醉后剃除腹部兔毛,常規(guī)進行消毒,沿腹中線逐層切開皮膚以暴露腹腔,尋找結(jié)腸,于植入部位上緣縱行切開一小口,切口0.8 cm,將支架植入結(jié)腸部位。支架固定后腹腔行抗感染處理,妥善縫合切口。

將植入白兔內(nèi)的支架分別在不同時間觀察點(2、5、8 d)取出,并在取出之前對每只兔子進行X線拍照。取支架周圍腸道組織和心臟及肝臟器官,以10%福爾馬林溶液固定24 h,石蠟包埋,3～5 μm連續(xù)切片制作石蠟切片,心臟及肝臟僅作蘇木精-伊紅染色法(HE染色)處理,腸道組織石蠟切片在Bcl-2抗體(以1∶200稀釋)及Bax抗體(以1∶200稀釋)中孵育。并使用免疫組化技術(shù)進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用方差分析；計數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 影像學(xué)分析 圖1a顯示腸內(nèi)明亮、高密度的網(wǎng)狀圓柱形管,這是鎂合金腸內(nèi)支架的X線顯影。圖1b顯示PLLA涂層的Mg-Zn-Y-Nd合金腸支架植入5 d后的X線顯影強度較植入2 d的腸道支架弱。圖1c顯示支架植入腸內(nèi)8 d時的X線顯影未被發(fā)現(xiàn)。實驗期間,未發(fā)現(xiàn)其他臟器損傷及穿孔、梗阻現(xiàn)象。

2.2 HE染色分析 術(shù)后第2天、第5天的肝臟組織形態(tài),從圖片可見術(shù)后第2天肝細(xì)胞核結(jié)構(gòu)無明顯異常,有少量炎性細(xì)胞浸潤到細(xì)胞間質(zhì),肝結(jié)構(gòu)形態(tài)無異常。術(shù)后第5天炎癥細(xì)胞浸潤較前減少,肝結(jié)構(gòu)形態(tài)無異常。見圖2a、b。術(shù)后第2天、第5天的腎臟組織形態(tài),而腎小球和腎小管形態(tài)無明顯異常,少量炎癥細(xì)胞滲出。術(shù)后5天腎臟組織炎癥細(xì)胞明顯減少。見圖2c、d。

2.3 免疫組化分析 術(shù)后2 d,PLLA涂層組Bax表達水平(17.3±1.6)%略高于空白對照組(17.0±1.3)%。裸支架組Bax表達水平(18.3±2.6)%略高于空白對照組,且裸支架組Bax表達水平稍高于PLLA涂層組。術(shù)后5 d,PLLA涂層組Bax表達水平(17.1±1.0)%較術(shù)后2 d稍降低,同時略高于空白對照組(16.6±1.2)%。但隨著時間推移,裸支架組Bax的表達水平始終略高于PLLA涂層組和空白對照組。在Bcl-2的表達方面,隨著支架植入時間延長,第5天PLLA涂層組表達水平(14.7±1.3)%較第2天(15.2±1.0)%稍降低,而且PLLA涂層組的Bcl-2表達水平在整個實驗期間均略低于裸支架組和稍高于空白對照組。但裸支架組與空白對照組之間Bcl-2表達水平在實驗期間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。術(shù)后2、5 d后,不同組間Bax和Bcl-2的表達水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見圖3。

圖1 PLLA/Mg-Zn-Y-Nd合金腸道支架植入新西蘭大白兔體內(nèi)不同時間X線片

圖2 健康家兔腸內(nèi)植入PLLA/Mg-Zn-Y-Nd合金支架后重要器官的病理學(xué)圖像

圖3 支架周圍腸道組織免疫組化結(jié)果

3 討論

腸道狹窄是一種常見的外科疾病,也是一些疾病或外科手術(shù)的并發(fā)癥。腸道支架不僅用于治療惡性腸狹窄,如結(jié)腸癌梗阻,而且適用于腸道的良性腸狹窄,例如結(jié)腸瘺、吻合口瘺、穿孔、炎性狹窄等［3-8］。目前,治療腸狹窄的支架包括自膨脹金屬支架、自膨脹塑料支架和生物可降解支 架［9,10］。然而,關(guān)于PLLA/Mg-Zn-Y-Nd鎂合金腸道支架的安全性研究尚未見詳細(xì)報道。

在本研究中,X線片提示,隨著植入時間的延長,支架在兔腸道環(huán)境的影響下逐漸降解。透過顯影還可以看到,未發(fā)現(xiàn)其他臟器損傷及穿孔、梗阻現(xiàn)象。待PLLA/Mg-Zn-Y-Nd合金支架植入兔體內(nèi)后,可以發(fā)現(xiàn)肝臟及腎臟組織的病理圖片均未見明顯異常。提示PLLA/Mg-Zn-Y-Nd合金支架植入動物體內(nèi)后并不能明顯引起機體系統(tǒng)炎癥反應(yīng),而且免疫組化實驗結(jié)果表明PLLA/Mg-Zn-Y-Nd合金支架降解產(chǎn)物對腸道組織細(xì)胞(尤其上皮細(xì)胞)的增殖無明顯誘導(dǎo)作用(P＞0.05)。這一結(jié)果表明PLLA/Mg-Zn-Y-Nd合金支架的短期植入并不利于引起腸道上皮細(xì)胞的內(nèi)皮化。有參考文獻［11］報道稱,AM50和WE43鑄造鎂合金對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及生長無明顯影響,具有良好的細(xì)胞相容性。

綜上所述,PLLA/Mg-Zn-Y-Nd腸道支架被植入新西蘭大白兔腸道內(nèi)后,未見引起其他臟器損傷及穿孔、梗阻現(xiàn)象,而且對腸道上皮細(xì)胞增殖無明顯促進作用,該支架具有良好的生物學(xué)安全性。