GC-FID 預(yù)測相對響應(yīng)因子法測定卷煙爆珠中辛,癸酸甘油酯含量

劉珊珊，鄧惠敏，楊 飛，吳晶晶，王 穎，范子彥，李小蘭*，李中皓*，邊照陽，唐綱嶺

1. 國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，鄭州市高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2 號 450001

2. 廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，南寧市北湖南路28 號 530001

近年來，爆珠型卷煙在國內(nèi)外市場發(fā)展迅速[1-2]。卷煙爆珠是用成膜材料制成的球形囊狀物，由一層壁材外殼包裹液體芯材制成。其中，壁材一般為明膠類物質(zhì)，芯材一般為香味物質(zhì)的中鏈甘油三酯混合溶液[3-4]。作為卷煙爆珠中香味成分的主要稀釋劑和增溶劑，食品添加劑辛,癸酸甘油酯（ODO）的應(yīng)用最為普遍[5-6]。由于ODO 在卷煙爆珠中質(zhì)量占比高，因此ODO 含量（質(zhì)量分數(shù)）往往是卷煙爆珠及其微量復(fù)雜香味成分穩(wěn)定性、均勻性等產(chǎn)品質(zhì)量評價的重要指征指標，而且由于ODO 具有較強的脂溶性，因此ODO 也可能是降低卷煙煙氣脂溶性有害成分釋放量的重要影響因素[7]。

食品中ODO 的相關(guān)定量檢測方法主要為氣相色譜（GC-FID）分析方法[8]和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）法[9]，但涉及的指標僅包括單辛酸甘油酯、單癸酸甘油酯。從ODO 的結(jié)構(gòu)式RCOOCH2CH（OCOR）CH2OCOR（R 為C8H17或C10H21）可以看出，ODO 是多種化合物的混合物，由于部分化合物目前在市場上不易購得高純度的標準品，因此制約了基于對應(yīng)標準品的傳統(tǒng)校準定量方法的應(yīng)用。

氫火焰離子化檢測器（FID）通過熱氫解作用使有機化合物轉(zhuǎn)化為CHO+，信號響應(yīng)值與化合物的碳原子數(shù)目成正比[10-11]。由于并非所有的碳原子都能最終轉(zhuǎn)化為CHO+，因此通過氣相色譜FID檢測器相對響應(yīng)值而得到的化合物的有效碳原子數(shù)即為有效碳數(shù)（Effective Carbon Number，ECN）。1962 年，Sternberg 等[12]提出了基于分析物分子結(jié)構(gòu)預(yù)測其在FID 的相對響應(yīng)因子（Relative Response Factor，RRF）的分析 方 法，即ECN 法。Jones[13]和Jorgensen 等[14]對這種方法的有效性進行了驗證。范國梁等[15]和Szulejko 等[16]將該方法用于無標準樣品的定量檢驗領(lǐng)域，也取得了良好的應(yīng)用效果。但是目前國內(nèi)外均未見采用該方法測定卷煙爆珠中ODO 含量的研究報道。因此，建立卷煙爆珠中ODO 含量的GC-FID 定量方法，探討ECN 預(yù)測RRF 方法在ODO 多組分混合物定量分析中應(yīng)用的可行性，旨在為卷煙爆珠產(chǎn)品的質(zhì)量評價提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

8 種不同加香類型的卷煙爆珠樣品，由廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供。

三辛酸甘油酯（≥99%）、十六碳烷（98.5%）（北京百靈威科技有限公司）；三癸酸甘油酯[＞98%，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司]；正己烷（色譜純，上海科醚化學(xué)科技有限公司）；ODO[食品級，道勤生物科技（上海）有限公司]。

7697A 頂空自動進樣器、7890B 氣相色譜儀（配FID 檢測器）、7890B/5977A 氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀、DB-5MS UI毛細管柱（15 m×0.25 mm×0.25 μm）（美國Agilent 公司）；AE163 電子天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler-Toledo 公司）；Balston 氫氣發(fā)生器（美國Parker 公司）。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液與內(nèi)標溶液的配制

采用正己烷作為溶劑，配制三辛酸甘油酯、三癸酸甘油酯和內(nèi)標正十六烷的單一標準儲備液，質(zhì)量濃度分別為2.5、2.5 和25 mg/mL。參考物質(zhì)（三辛酸甘油酯或三癸酸甘油酯）系列標準工作溶液的配制：分別移取0.025、0.500、1.000、1.500 和2.000 mL 的參考物質(zhì)單一標準儲備液于10 mL 容量瓶中；加入內(nèi)標儲備液100 μL，以正己烷定容；每級系列標準工作曲線中參考物質(zhì)的質(zhì)量分別為0.062 5、1.250 0、2.500 0、3.750 0 和5.000 0 mg。

1.2.2 樣品處理和分析

爆珠樣品：取1 粒爆珠樣品稱量，精確至0.1 mg，置于剪裁過的3 mL 塑料吸管中，擠破爆珠后，將含有擠破爆珠的塑料吸管一并放入50 mL 離心管中，加入10 mL 正己烷和100 μL 內(nèi)標儲備液，于1 000 r/min 的轉(zhuǎn)速下渦旋振蕩5 min，取約2 mL 上清液進行GC 分析。

含爆珠的濾嘴樣品：將卷煙濾嘴拆下后，捏破濾嘴中的爆珠，將濾嘴置于50 mL 離心管中，加入10 mL 正己烷和100 μL 內(nèi)標儲備液，超聲萃取60 min，取約2 mL 上清液進行GC 分析。

1.2.3 GC-FID 條件

色譜柱：DB-5MS UI 柱；進樣口溫度：325 ℃；載氣：氦氣（99.999%）；恒流模式；柱流速：1.0 mL/min；進樣體積：1.0 μL；分流比：25∶1；程序升溫：180 ℃保持1 min，以30 ℃/min 升溫至300 ℃，保持15 min；總運行時間：20 min；檢測器溫度：300 ℃；尾吹氣：氮氣（99.999%），30 mL/min；空氣：400 mL/min；氫氣：40 mL/min。

1.2.4 GC-MS 條件

GC 條件與1.2.3 節(jié)相同。MS 傳輸線溫度：300 ℃；電離方式：電子轟擊源（EI）；電離能量：70 eV；離子源溫度：280 ℃；四極桿溫度：150 ℃；檢測方式：全掃描監(jiān)測模式（SCAN）；掃描范圍：29～600 amu。

1.2.5 定量分析

分別以三辛酸甘油酯和三癸酸甘油酯作為參考物質(zhì)（Reference Compound，RM），按照公式（1）計算獲得ODO 各組分單位摩爾質(zhì)量相對響應(yīng)因子（RRFi）。

式中：R RFi為分析物i 單位摩爾質(zhì)量相對響應(yīng)因子；MWi為分析物i 摩爾質(zhì)量，g/mol；MWR為參考物質(zhì)摩爾質(zhì)量，g/mol；ECNR為參考物質(zhì)的有效碳數(shù)（表4）；ECNi為分析物i 的有效碳數(shù)。

以正十六烷為內(nèi)標，采用內(nèi)標法計算ODO 總量，按照公式（2）計算：

式中：wODO為ODO 總量，mg；RRFi為分析物i單位摩爾質(zhì)量相對響應(yīng)因子；Ai為樣品中分析物i響應(yīng)峰面積；AIS（i）為樣品中內(nèi)標物響應(yīng)峰面積；kR為參考物質(zhì)標準工作曲線斜率。

2 結(jié)果與討論

2.1 ODO 各組分的定性

ODO 混合物可能包括7 大類組分[17]，除了三辛酸甘油酯和三癸酸甘油酯之外，其他5 類物質(zhì)均至少存在2 種以上同分異構(gòu)體，ODO 各組分如表1 所示。按照1.2 節(jié)方法對食品添加劑ODO 的正己烷稀釋溶液進行檢測，得到ODO 的色譜圖（圖1），確定了ODO 混合物各組出峰順序和保留時間。采用相同的氣相色譜條件，對ODO 混合物進行GC-MS 全掃描分析，所有組分的質(zhì)譜圖見圖2?？梢钥闯觯谑称诽砑觿㎡DO 中，甘油三酯的色譜峰（三辛酸甘油酯、單癸酸二辛酸甘油酯、單辛酸二癸酸甘油酯和三癸酸甘油酯）在FID 上響應(yīng)值較高，而甘油二酯（二辛酸甘油酯、單辛酸癸酸甘油酯、二癸酸甘油酯）含量較低。

表1 辛,癸酸甘油酯化合物信息Tab.1 Information of ODO components

圖1 辛,癸酸甘油酯氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of ODO obtained by GC-FID

圖2 辛,癸酸甘油酯檢出組分的質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectrogram for detectable components in ODO

2.2 超聲萃取時間的優(yōu)化

直接將濾嘴中爆珠捏破并進行萃取時，為了保證將爆珠中的辛,癸酸甘油酯萃取完全，對超聲萃取的時間進行了優(yōu)化，結(jié)果見圖3?？梢钥闯?，當(dāng)超聲萃取60 min 后，基本達到萃取平衡。

圖3 超聲時間對辛,癸酸甘油酯提取量的影響Fig.3 Influence of ultrasonic time on extraction efficiency of ODO

2.3 ECN 和RRF 的計算

本研究中，按照ECN 計算規(guī)則[18]對ODO 各ECN 進行了計算。ODO 各組分化合物存在的官能團包括酯和醇兩種。其中，酯對ECN 的影響為-1.25；伯醇、仲醇、叔醇對ECN 的影響分別為-0.60、-0.75、-0.25?？紤]到甘油二酯會存在伯醇和仲醇兩種同分異構(gòu)體的情況，為簡化定量處理，將伯醇和仲醇對碳數(shù)影響的平均值（-0.675）作為醇對ODO 碳數(shù)的影響值。得到的ODO 各化合物ECN 值見表2。分別以三辛酸甘油酯和三癸酸甘油酯作為參考物質(zhì)，按照1.2 節(jié)公式（1）計算所獲得的ODO 各組分單位摩爾質(zhì)量相對響應(yīng)因子（RRFi），如表3 所示，化合物結(jié)構(gòu)與參考物質(zhì)越接近，則RRFi的值越接近1.00。

2.4 參考物質(zhì)的標準工作曲線

取5 級系列標準工作溶液進行GC-FID 分析，以各標準工作溶液中參考物質(zhì)峰面積AR與內(nèi)標物峰面積AIS（R）之比為縱坐標，以各標準工作溶液中參考物質(zhì)的含量（mg）為橫坐標，繪制參考物質(zhì)的標準工作曲線（強制過原點）。標準工作曲線的擬合結(jié)果（圖4）表明，參考物質(zhì)在0～0.5 mg/mL 濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，R2大于0.997。三辛酸甘油酯和三癸酸甘油酯參考物質(zhì)標準工作曲線斜率（kR）分別為0.307 2 和0.316 7。

表2 辛,癸酸甘油酯化合物ECN 值Tab.2 Calculation of ECN for separated components from ODO

表3 辛,癸酸甘油酯各組分RRFi值Tab.3 Calculation of RRFi for separated components from ODO

圖4 參考物質(zhì)標準工作曲線Fig.4 Calibration curves of reference compounds

2.5 食品添加劑ODO 含量的驗證

以食品添加劑ODO 作為研究對象，分別準確移取0.25、0.50、1.00 mL 的19.91 mg/mL ODO 正己烷溶液于3 個10 mL 容量瓶中，再分別添加100 μL內(nèi)標溶液，定容后得到低、中、高3 個不同濃度水平的ODO 稀釋溶液。按照1.2 節(jié)GC-FID 檢測條件進行儀器分析，每個濃度水平下平行測定3 次，獲得的Ai和AIS（i）如表4 所示。按照1.2 節(jié)公式（2）計算ODO 總含量，從定量結(jié)果（表5）可以看出，當(dāng)采用三辛酸甘油酯和三癸酸甘油酯作為參考物質(zhì)時，3 個含量水平ODO 總量計算結(jié)果與配制溶液實際濃度的相對偏差小于3.5%?？梢?，采用GC-FID 有效碳數(shù)預(yù)測相對響應(yīng)因子內(nèi)標法對ODO 各組分進行定量分析具有可行性。

表4 3 個濃度下辛,癸酸甘油酯色譜峰面積檢測結(jié)果（n=3）Tab.4 Determination results of peak areas of ODO detected at three concentrations levels（n=3）

表5 3 個濃度下辛,癸酸甘油酯含量檢測結(jié)果Tab.5 Determination results of ODO contents at three concentration levels

2.6 卷煙爆珠中ODO 定量檢測的方法學(xué)評價

按照1.2 節(jié)樣品前處理條件，以食品添加劑ODO 為加標物，對實際卷煙爆珠樣品進行3 水平加標回收率和精密度實驗，每個加標水平重復(fù)測定5 次，回收率和精密度結(jié)果如表6 所示?？梢钥闯觯诓捎萌了岣视王セ蛉锼岣视王プ鳛閰⒖嘉镔|(zhì)的條件下，卷煙爆珠中ODO 含量的加標回收率在98.0%～108.0%之間，RSD≤2.0%。通過逐級稀釋標準樣品溶液，并按信噪比S/N=10 計算得到分析方法ODO 各組分的定量限（LOQ）為0.05 mg/mL。

表6 方法回收率和精密度①（n=5）Tab.6 Recovery and accuracy of this method（n=5） （%）

2.7 實際樣品檢測結(jié)果

對廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司所提供的8 個卷煙爆珠樣品進行檢測，結(jié)果如表7 所示。實際樣品檢測結(jié)果表明：8 個卷煙爆珠中均檢出了ODO，含量在23%～87%之間；在卷煙爆珠ODO 各組分中，甘油三酯4 個組分的含量占比在93%以上，甘油二酯3 個組分占ODO 總量的6%左右；分別以三辛酸甘油酯和三癸酸甘油酯為參考物質(zhì)時，所得辛,癸酸甘油酯含量的一致性較好，平均相對偏差≤2.5%。

表7 卷煙爆珠實際樣品檢測結(jié)果Tab.7 Results of ODO content in breakable capsules in commercial cigarette samples （%）

3 結(jié)論

建立了ODO 各組分以及卷煙爆珠中ODO 含量的GC-FID 定量分析方法，結(jié)果表明基于分析物ECN 預(yù)測RRF 法定量分析ODO 混合物組分是可行的。本方法僅需要采用三辛酸甘油酯或三癸酸甘油酯作為參考物質(zhì)，解決了ODO 混合物多組分標準品不易獲得的問題；在0～0.5 mg/mL 范圍內(nèi)，工作曲線的R2＞0.997，加標回收率為98.0%～108.0%，RSD≤2.0%，ODO 各組分的LOQ 為0.05 mg/mL。8 個不同加香類型爆珠樣品中ODO 含量為23%～87%，其中甘油三酯占比在93%以上，甘油二酯占比在6%左右；采用兩種參考物質(zhì)的計算結(jié)果的一致性良好。本方法前處理簡單、測定結(jié)果準確，可為食品添加劑ODO 組分定量，以及卷煙爆珠相關(guān)質(zhì)量分析提供方法參考。