韓寧寧，趙富華，戴青，趙暉，楊秀玉，于曉輝

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

伊維菌素吡喹酮咀嚼片是“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目研制的新制劑，由伊維菌素、吡喹酮和賦形劑制成的咀嚼片，用于寵物犬體內(nèi)外寄生蟲的治療。伊維菌素是大環(huán)內(nèi)酯類體內(nèi)外驅(qū)蟲藥[1]，對(duì)絲蟲、鉤蟲、圓蟲、鞭蟲、蛔蟲等均有效果；吡喹酮[2]對(duì)動(dòng)物體內(nèi)線蟲、吸蟲、絳蟲有效。通過兩種藥物組合，擴(kuò)大驅(qū)蟲譜，可提高一次性驅(qū)蟲效果。為保證該制劑的質(zhì)量可控，安全有效，需建立相應(yīng)含量測(cè)定方法。本文創(chuàng)建了同時(shí)測(cè)定伊維菌素與吡喹酮的高效液相含量測(cè)定方法，并根據(jù)《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》[3]的要求，對(duì)上述方法進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 儀器與試劑

1.1 儀器與設(shè)備 高效液相色譜儀(HPLC)(Waters e2695色譜系統(tǒng)，Empower 3色譜工作站)；二極管陣列檢測(cè)器(PDA)(Waters 2998)；XS205分析天平(Mettler Toledo)。

1.2 藥品與試劑 對(duì)照品名稱/來源/批號(hào)/含量：伊維菌素/中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所/K0191406/91.0%；吡喹酮/中國(guó)食品藥品檢定研究院/100046-201205/99.7%。3批伊維菌素吡喹酮咀嚼片規(guī)格/生產(chǎn)企業(yè)/批號(hào)：伊維菌素2 mg與吡喹酮50 mg/東方澳龍制藥有限公司/20170501、20170502、20170503。乙腈(MERCK公司色譜純?cè)噭?。其余試劑均為分析純。

2 方 法

2.1 方法的建立過程

2.1.1 液相色譜條件的建立 采用《中國(guó)獸藥典》吡喹酮含量測(cè)定液相色譜條件(乙腈∶水60∶40)，采集吡喹酮與伊維菌素混合對(duì)照品色譜圖，發(fā)現(xiàn)該條件下吡喹酮出峰時(shí)間為6 min，伊維菌素出峰時(shí)間為120 min。如采用該色譜條件僅進(jìn)行吡喹酮含量測(cè)定，伊維菌素會(huì)對(duì)多批次測(cè)定的后續(xù)樣品的吡喹酮含量測(cè)定產(chǎn)生干擾。

為排除伊維菌素對(duì)吡喹酮測(cè)定的干擾，保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，需將伊維菌素與吡喹酮的液相色譜條件合并。合并后的色譜條件需使伊維菌素與吡喹酮在20 min內(nèi)均出峰，溶劑及輔料對(duì)主成分測(cè)定需均無干擾，且相應(yīng)分離度及塔板數(shù)均應(yīng)符合藥典要求。

2.1.2 提取溶劑的選擇 分別用甲醇及60%乙腈溶液配制0.2 mg/mL的伊維菌素對(duì)照品溶液和5.0 mg/mL的吡喹酮對(duì)照品溶液(上述濃度與供試品擬采用的配制濃度一致)?？疾鞂?duì)照品是否能完全溶解，根據(jù)測(cè)定結(jié)果選擇合適的溶劑。

2.1.3 提取時(shí)間的選擇 取片劑適量，研磨后精密稱定，置錐形瓶中，精密加入10 mL甲醇，平行制備4份。各自分別超聲0、2、5、10 min，配制相當(dāng)于伊維菌素0.2 mg/mL的供試品溶液，測(cè)定含量，考察提取時(shí)間。根據(jù)測(cè)定結(jié)果選擇合適的提取時(shí)間。

2.1.4 溶液濃度的選擇 《中國(guó)獸藥典》中伊維菌素進(jìn)樣濃度為0.2 mg/mL，吡喹酮為0.05 mg/mL。照上述方法配制相當(dāng)于伊維菌素0.2 mg/mL的溶液及相當(dāng)于吡喹酮0.05 mg/mL的溶液，考察測(cè)定含量與標(biāo)示含量的差異。通過測(cè)定回收率，進(jìn)一步確定配制方法準(zhǔn)確度是否符合要求。

2.1.5 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 《中國(guó)獸藥典》中伊維菌素檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，USP中伊維菌素檢測(cè)波長(zhǎng)為245 nm。《中國(guó)獸藥典》及USP中吡喹酮檢測(cè)波長(zhǎng)均為210 nm。通過PDA檢測(cè)器采集伊維菌素及吡喹酮光譜圖，考察伊維菌素與吡喹酮最大吸收波長(zhǎng)，并結(jié)合各藥典方法，確定合適的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 最終建立的含量測(cè)定方法 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以水為流動(dòng)相A，以乙腈為流動(dòng)相B，照表1進(jìn)行梯度洗脫，伊維菌素檢測(cè)波長(zhǎng)為245 nm，吡喹酮檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。理論塔板數(shù)按吡喹酮峰和伊維菌素H2B1a峰計(jì)算，均應(yīng)不低于3000，伊維菌素H2B1a與H2B1b峰的分離度應(yīng)不小于3.0，吡喹酮峰與相鄰峰的分離度應(yīng)不小于1.5。

測(cè)定法。取本品20片，精密稱定，計(jì)算平均片重。研細(xì)，取約0.8 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，超聲5 min，靜置至室溫，取上清液過濾，作為伊維菌素供試品溶液；精密量取上述溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為吡喹酮供試品溶液。取伊維菌素和吡喹酮對(duì)照品適量，用甲醇分別配制為每1 mL中約含0.2 mg和0.05 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液，同法測(cè)定。精密量取上述對(duì)照品溶液和供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。

表1 含量測(cè)定梯度洗脫條件Tab 1 Gradient elution condition for content determination

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 專屬性 采集提取溶劑、輔料、對(duì)照品及供試品溶液色譜圖，考察提取溶劑及輔料在伊維菌素及吡喹酮出峰時(shí)間有無干擾。

2.3.2 檢測(cè)限與定量限 配制不同濃度伊維菌素及吡喹酮對(duì)照品溶液測(cè)定相應(yīng)信噪比，以信噪比約為3∶1時(shí)的濃度為檢測(cè)限，信噪比約為10∶1時(shí)的濃度為定量限。

2.3.3 線性和范圍 分別配制濃度為2、4、10、20、40、80、200、400 μg/mL的伊維菌素對(duì)照品溶液，及濃度為1、2、5、10、20、50、100 μg/mL的吡喹酮對(duì)照品溶液，采集色譜圖，以峰面積與對(duì)照品濃度作圖，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸?？疾煸谏鲜鰞蓚€(gè)濃度范圍內(nèi)，伊維菌素及吡喹酮峰面積與濃度是否線性關(guān)系良好。

2.3.4 準(zhǔn)確度 取空白輔料0.75 g，精密加入伊維菌素對(duì)照品2 mg及吡喹酮對(duì)照品50 mg，置錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，超聲5 min，靜置至室溫，取上清液濾過，精密量取濾液20 μL注入液相色譜儀，采集245 nm色譜圖。精密量取續(xù)濾液1 mL，置100 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取上述溶液20 μL注入液相色譜儀，采集210 nm色譜圖。平行配制6份上述100%濃度水平的供試品溶液，分別測(cè)定伊維菌素及吡喹酮回收率。

2.3.5 精密度(中間精密度) 兩位檢驗(yàn)員各測(cè)定該批片劑的3份平行樣品，伊維菌素相對(duì)平均偏差應(yīng)小于6%，吡喹酮相對(duì)平均偏差應(yīng)小于4%。

2.3.6 溶液穩(wěn)定性 考察伊維菌素及吡喹酮對(duì)照品溶液室溫放置24 h內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)伊維菌素及吡喹酮主峰面積的變化以評(píng)價(jià)溶液穩(wěn)定性。

2.3.7 耐用性 考察不同柱溫(25、30、35 ℃)、流速(0.8、1.0、1.2 mL/min)、不同品牌色譜柱對(duì)耐用性的影響。

3 結(jié)果與分析

3.1 方法的建立過程

3.1.1 液相色譜條件的建立 采用整合后的色譜系統(tǒng)(表1)，使吡喹酮在乙腈∶水(60∶40)的梯度范圍(0～6 min)內(nèi)出峰，伊維菌素在乙腈∶水(100∶0)的梯度范圍(6.01～17 min)內(nèi)出峰，溶劑及輔料對(duì)主成分測(cè)定均無干擾，且相應(yīng)分離度及塔板數(shù)均符合藥典要求(圖3～圖10)。

3.1.2 提取溶劑的選擇 甲醇或60%乙腈兩種溶劑均可使兩種對(duì)照品完全溶解?？紤]到甲醇作為溶劑無需配制，更為簡(jiǎn)單方便，選取甲醇作為提取溶劑。

3.1.3 提取時(shí)間的選擇 根據(jù)表2結(jié)果，超聲5 min后，測(cè)定結(jié)果不再升高，提示主成分已全部溶解。因此，確定提取方式為：以甲醇作為溶劑，超聲5 min。

表2 提取時(shí)間的選擇Tab 2 Selection of extraction time

3.1.4 溶液濃度的選擇 照2.1.4所示濃度配制供試品溶液，三批供試品測(cè)定含量均在標(biāo)示含量的100%左右，結(jié)果見表3。回收率結(jié)果見3.2.4項(xiàng)，伊維菌素與吡喹酮回收率均符合要求。提示伊維菌素進(jìn)樣濃度為0.2 mg/mL，吡喹酮進(jìn)樣濃度為0.05 mg/mL為合理的溶液濃度。

3.1.5 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 通過PDA檢測(cè)器采集伊維菌素及吡喹酮光譜圖，發(fā)現(xiàn)伊維菌素最大吸收波長(zhǎng)為244.2 nm，吡喹酮在200～230 nm之間無明顯波峰，但吸收由高至低下降(圖1～圖2)。故采用245 nm作為伊維菌素的檢測(cè)波長(zhǎng)，210 nm作為吡喹酮的檢測(cè)波長(zhǎng)。

表3 三批供試品含量測(cè)定結(jié)果Tab 3 Determination results of three batches of samples

圖1 伊維菌素H2B1a PDA光譜圖Fig 1 PDA spectrum of Ivermectin H2B1a

圖2 吡喹酮PDA光譜圖Fig 2 PDA spectrum of praziquantel

3.2 方法學(xué)驗(yàn)證

3.2.1 專屬性 提取溶劑及輔料在伊維菌素及吡喹酮出峰時(shí)間均無干擾(圖3～圖10)。

3.2.2 檢測(cè)限與定量限 該方法伊維菌素H2B1a檢測(cè)限為0.4 μg/mL，定量限為1.2 μg/mL。吡喹酮檢測(cè)限為0.5 μg/mL，定量限為1.0 μg/mL。

圖3 甲醇在210nm下色譜圖Fig 3 Chromatogram of methanol at 210 nm

圖4 輔料在210nm下色譜圖Fig 4 Chromatogram of excipients at 210 nm

圖5 吡喹酮對(duì)照品在210nm下色譜圖Fig 5 Chromatogram of praziquantel reference at 210 nm

圖6 供試品在210nm下色譜圖Fig 6 Chromatogram of the sample at 210 nm

圖7 甲醇在245nm下色譜圖Fig 7 Chromatogram of methanol at 245 nm

圖8 輔料在245nm 下色譜圖Fig 8 Chromatogram of excipients at 245 nm

圖9 伊維菌素對(duì)照品在245nm下色譜圖Fig 9 Chromatographic Chart of Ivermectin Reference at 245 nm

圖10 供試品在245nm下色譜圖Fig 10 Chromatogram of the sample at 245 nm

3.2.3 線性和范圍 伊維菌素峰面積與濃度線性方程為：y=41323x-95474，r=0.9999；吡喹酮峰面積與濃度線性方程為：y=95361x-27338，r=0.9999。表明伊維菌在2～400 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，吡喹酮在1～100 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度線性關(guān)系良好。

3.2.4 準(zhǔn)確度 處方回收率結(jié)果如表4所示。結(jié)果符合要求。

3.2.5 中間精密度 結(jié)果如表5～表6所示。結(jié)果符合要求。

表4 伊維菌素及吡喹酮回收率結(jié)果Tab 4 Result of recovery of ivermectin and praziquantel

表5 伊維菌素精密度測(cè)定結(jié)果Tab 5 Precision determination results of ivermectin

表6 吡喹酮精密度測(cè)定結(jié)果Tab 6 Precision determination results of praziquantel

3.2.6 溶液穩(wěn)定性 結(jié)果如表7所示。伊維菌素對(duì)照品溶液在室溫放置2 h內(nèi)穩(wěn)定，之后峰面積逐漸降低，但24 h內(nèi)RSD仍僅為0.9%，基本穩(wěn)定；吡喹酮對(duì)照品溶液在室溫放置24 h穩(wěn)定。

3.2.7 耐用性 結(jié)果如表8所示。在該表所述各個(gè)條件下，理論塔板數(shù)按H2B1a峰計(jì)算均不低于3000，伊維菌素H2B1a與H2B1b峰的分離度均不小于3.0，理論板數(shù)按吡喹酮峰計(jì)算均不低于3000。

4 討論與結(jié)論

由于處方中伊維菌素與吡喹酮兩種主藥規(guī)格差異較大(2 mg與50 mg)，如果為簡(jiǎn)化試驗(yàn)操作，采用相同的進(jìn)樣濃度，在伊維菌素與吡喹酮各自的最大吸收波長(zhǎng)(245 nm與210 nm)附近提取色譜圖，會(huì)導(dǎo)致伊維菌素峰面積過小，或者吡喹酮峰面積過載，二者均影響測(cè)定的準(zhǔn)確性，因而本方法伊維菌素和吡喹酮采用了兩種不同的供試品濃度進(jìn)樣。

但如果伊維菌素和吡喹酮均采用245 nm作為提取波長(zhǎng)，采用未經(jīng)第二步稀釋的伊維菌素供試品溶液進(jìn)樣，同時(shí)測(cè)定伊維菌素和吡喹酮，二者峰面積均處于合適的范圍(圖11)，且無需進(jìn)一步稀釋配制吡喹酮供試品溶液，簡(jiǎn)化了試驗(yàn)操作。采用該簡(jiǎn)化方法測(cè)定批號(hào)為20170502的供試品，結(jié)果與最終采用的方法相比，無顯著差異(表9)。但考慮到245 nm恰好處于吡喹酮紫外光譜圖的波谷位置，儀器對(duì)于濃度變化的靈敏度較低，易產(chǎn)生試驗(yàn)誤差，因此，最終未采用該簡(jiǎn)化方法。

表7 伊維菌素及吡喹酮穩(wěn)定性結(jié)果Tab 7 Stability results of ivermectin and praziquantel

表8 耐用性結(jié)果Tab 8 Durability results

圖11 245 nm下伊維菌素與吡喹酮色譜圖Fig 11 Chromatogram of ivermectin and praziquantel at 245 nm

供試品含量1/%供試品含量2/%平均值/%簡(jiǎn)化方法98.7799.0298.9最終采用的方法98.2199.5698.9