魯凱珩 金清 曹沁 李珊珊 孫舒榮 蔣秋艷 金杰人 凌麗晨 符歆灝 杜萱 肖明

摘 要： 對貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）S3-1與桔黃假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca）JD37進行測定發(fā)現(xiàn)：兩者都具有良好的促生能力.將兩者制備成相應的液體肥料，施加于種植西紅柿的土壤中，發(fā)現(xiàn)S3-1能更顯著提升西紅柿果實中的可溶性糖、可溶性蛋白、可滴定酸、抗壞血酸的含量.對西紅柿根際土壤進行平板涂布，發(fā)現(xiàn)S3-1能夠有效地阻擋更多微生物，尤其是細菌進入植物的根際.使用S3-1生物肥料后，西紅柿的干重、根長未見明顯變化.進一步的研究顯示：S3-1生物肥料顯著降低了土壤的脲酶活性，卻對土壤蔗糖酶活性沒有太大的影響.

關鍵詞： 貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）; 桔黃假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca）; 菌種性質(zhì); 果實品質(zhì); 土壤酶活性

中圖分類號： Q 93文獻標志碼： A文章編號： 1000-5137（2019）02-0197-10

0 引 言

西紅柿（Lycopersicon esculentum Mill.）栽培廣泛，且隨著蔬菜種植業(yè)的發(fā)展，其種植面積還在不斷擴大，生產(chǎn)效益顯著[1-2].施用化肥能夠有效地提升西紅柿的產(chǎn)量，但是過度施用也會造成土壤的酸、堿化，破壞土壤微生物區(qū)系和自然農(nóng)業(yè)的生態(tài)系統(tǒng).微生物肥料是一種含有相應活性微生物的生物制劑，具有無毒、無污染的特性，具有廣闊的應用前景[3].

芽孢桿菌（Bacillus）具有良好的促生能力，可通過浸種、澆施、灌根等多種方法在多種蔬菜、果樹和作物上使用.解淀粉芽孢桿菌Sneb709能有效地促進西紅柿果實的質(zhì)量[4];以芽孢桿菌為主要成分的仙豐168經(jīng)過200倍稀釋，能有效提升西紅柿的株高[1];解淀粉芽孢桿菌B1619則提升了西紅柿幼苗的株高、鮮重、干重等[5].但貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）對于西紅柿的促生影響以及對土壤酶活性的影響還鮮有報道.

假單胞菌（Pseudomonas）是一類重要的土壤微生物，其在不同的土壤微生物群落中的占比為1%～34%，同時也是一類重要的植物根際促生菌（PGPR），常作為生防細菌以及促生細菌來使用[6-7].現(xiàn)階段假單胞菌的促生作用主要集中在小麥、蔞蒿[8]、蘑菇[9]等作物上，關于其對西紅柿的影響的研究則側(cè)重于病害防治方面，而關于其對西紅柿的促生能力的報道較少.

本實驗研究了兩株菌株貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）S3-1與桔黃假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca）JD37對于西紅柿品質(zhì)以及土壤酶活性的影響之間的差異，希望為后續(xù)的微生物肥料的制備與應用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料西紅柿S18-02幼苗由上海師范大學種質(zhì)資源中心提供，貝萊斯芽孢桿菌S3-1（B.velezensis）與桔黃假單胞菌JD37（P.chlororaphis subsp.aurantiaca）由上海師范大學微生物與分子生物學實驗室保藏.實驗試劑包括：鉻天青S（Chromeazurol S）固體平板，NBRIP溶磷固體培養(yǎng)基，ADF培養(yǎng)基，無菌脫脂牛奶培養(yǎng)基，salkowski試劑，Luria-Bertani（LB）液體培養(yǎng)基，Kings Medium B（KMB）液體培養(yǎng)基，高氏一號培養(yǎng)基，孟加拉紅培養(yǎng)基，牛肉膏蛋白胨（NB）培養(yǎng)基.

1.2 菌種性質(zhì)鑒定[10-11]將4 ℃下保藏在平皿中的S3-1與JD37分別接種至LB液體培養(yǎng)基與KMB液體培養(yǎng)基中，活化24 h后得到種子液.接種至新的LB與KMB培養(yǎng)基中再培養(yǎng)24 h后得到發(fā)酵液，用移液槍小心地吸取1 μL發(fā)酵液點于CAS固體平板、NBRIP溶磷固體培養(yǎng)基上，觀察其是否是產(chǎn)鐵載體和其溶磷的能力.將上述溶液進行梯度稀釋后吸取100 μL均勻地涂布在ADF培養(yǎng)基（培養(yǎng)基現(xiàn)配現(xiàn)用，無法加熱重復使用）中，若干天后觀察是否有菌落產(chǎn)生.利用salkowski法測定細菌產(chǎn)吲哚乙酸（IAA）的能力.

1.3 菌株生物信息學分析將S3-1和JD37分別與已有文獻中證明具有植物促生能力的芽孢桿菌與桔黃假單胞菌根據(jù)16S rDNA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以便對其應用潛力進行分析.

1.4 大田實驗設計于2018年4月—7月開展大田實驗.大田共分為6塊，每塊面積為1.5 m×3.5 m，縱向間隔35 cm移栽一株西紅柿幼苗，橫向間隔30 cm移栽一株西紅柿幼苗，每塊地共移栽45株幼苗，總計移栽幼苗180株（圖1）.按上文方式活化S3-1與JD37后，以1%的接種量接種于新的LB與KMB液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)24 h，得到發(fā)酵液.空白對照使用未經(jīng)接種的LB與KMB液體培養(yǎng)基.將兩者均以1∶50的體積比加水稀釋[12].每隔7 d以灌根的方式對西紅柿進行菌液澆灌，每天在每塊地塊定量澆水10 L以保持土壤濕潤.

1.5 西紅柿根際可培養(yǎng)微生物數(shù)量及其根長、株高和植株干重的測定種植前采集土壤樣品A，待到西紅柿成熟時將西紅柿植株連根拔出，收集其根系土壤B[13].將1 g土壤置于9 mL無菌水中，震蕩均勻，再取1 mL溶液至9 mL無菌水中，該過程重復3次，分別制備成體積分數(shù)為1×10-3與1×10-4的混懸液α，β.用移液槍取100 μL混懸液β分別涂布于NB固體培養(yǎng)基與高氏一號固體培養(yǎng)基上，計數(shù)細菌與放線菌;吸取100 μL混懸液α涂布于孟加拉紅固體培養(yǎng)基，計數(shù)真菌數(shù)量;待菌體形成明顯菌落后，記錄菌落數(shù)[14].

通過以下公式來觀察不同處理組西紅柿根際可培養(yǎng)微生物數(shù)量的變化：其中，C為變化率，a為土壤A中的微生物數(shù)量，b為土壤B中的微生物數(shù)量.將西紅柿植株在烘箱內(nèi)以105 ℃恒溫烘干至恒重后測量其根長、株高和干重.

1.6 西紅柿果實品質(zhì)的測定

采集同一批成熟的西紅柿果實，進行勻漿后，使用手持式折光儀分別測定其可溶性固形物;用滴定法測定其可滴定酸;用二氯酚靛酚染料滴定法測定其抗壞血酸;用蒽酮法測定其可溶性糖;用考馬斯亮藍比色法測定其可溶性蛋白;用紫外分光光度法測定其硝酸鹽的含量[15].

1.7 土壤酶活性測定

對根際土壤分別測定了脲酶和蔗糖酶的酶活性[16].

1.8 實驗數(shù)據(jù)處理

使用以下軟件處理數(shù)據(jù)：SPSS 24.0，Origin 2017，MEGA7.0.21.

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種性質(zhì)

圖2（a）為得到的IAA質(zhì)量濃度與535 nm波長下吸光度（即光密度OD535）值的標準曲線，圖2（b）為利用標準曲線得到的S3-1與JD37產(chǎn)IAA的量隨時間變化的趨勢圖.由圖2可知：S3-1的IAA最高產(chǎn)量雖不如JD37，且也不能快速地產(chǎn)生IAA，但其最高產(chǎn)量（7.80 μg·mL-1）能維持2 d才出現(xiàn)緩慢下降;而JD37能快速達到其最高產(chǎn)量（8.75 μg·mL-1），但其下降也非常迅速，第3 d開始處于較穩(wěn)定階段時其IAA產(chǎn)量已經(jīng)較低.所以S3-1相較于JD37，在產(chǎn)IAA的能力方面穩(wěn)定性更強，更為可靠.

S3-1與JD37都具有產(chǎn)蛋白酶的活性以及產(chǎn)1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶（ACC）脫氨酶的活性，而S3-1具有產(chǎn)鐵載體的能力，JD37具有溶磷活性.以上性質(zhì)均是良好的植物促生細菌所具有的能力，所以適合后續(xù)實驗的開展.

2.2 菌種生物信息學分析

通過與已知的具有植物促生能力的功能菌株[17-31]進行比對發(fā)現(xiàn)，S3-1與JD37與這些菌株的親緣關系較近（圖3）.例如：桔黃假單胞菌SR1是一種已有報道可用于大豆的生物防治以及促生的菌株，JD37與其具有較近的親緣關系，說明該菌株在生物防治與促生應用方面可能具有良好的潛力[32].

2.3 西紅柿果實干重、根際可培養(yǎng)微生物數(shù)量變化率及其根長、株高的測定結(jié)果

不同處理組的果實干重、根際微生物數(shù)量變化率、根長和株高分別如圖4（a）～4（c）所示.

由圖4可知：S3-1與JD37菌液并沒有對提高西紅柿的果實干重起到顯著的促進作用;JD37對增加西紅柿株高有顯著效果，同時也抑制了西紅柿根部的生長（p<0.05）.而S3-1對于西紅柿株高與果實干重的影響與不接種菌株的LB培養(yǎng)基相比的差異并不顯著.由于植物根際存在根際效應，所以其微生物數(shù)量僅有非根際土壤中的5%左右，絕大部分文獻均以富集率來表示根際微生物的根際效應[33].但這種方式卻忽略了不同地塊本身存在的微生物數(shù)量之間的差異，因此本實驗采用變化率來表征根際微生物數(shù)量的變化.施加S3-1，JD37的處理組與未接種細菌的對照組相比，其細菌、放線菌的變化率均顯著增高（p<0.05）.

2.4 果實品質(zhì)測定結(jié)果

施加了S3-1的處理組，其可溶性糖質(zhì)量濃度比僅施加LB基質(zhì)的對照組顯著提升（p<0.05），但是與施加JD37的處理組相比，提升并不顯著，而施加JD37的處理組與僅施加KMB基質(zhì)的對照組的可溶性糖質(zhì)量濃度相比并沒有顯著差異.就硝酸鹽質(zhì)量濃度而言，4個組均沒有顯著的差異（p>0.05），如圖5（a）所示.施加S3-1的處理組相較于只施加LB基質(zhì)的對照組，在可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)的提升上并不顯著（p>0.05），但是與施加JD37的處理組與僅施加KMB基質(zhì)的對照組相比，可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)顯著提升（p<0.05）.施加了S3-1的處理組的可滴定酸質(zhì)量濃度與僅施加LB基質(zhì)的對照組相比顯著上升（p<0.05），但與施加JD37的處理組與僅施加KMB基質(zhì)的對照組相比，提升并不顯著（p>0.05），如圖5（b）所示.本實驗用消耗的二氯酚靛酚體積來表示抗壞血酸含量，施加了S3-1，JD37的處理組與僅施加基質(zhì)的對照組相比，均顯著提升了西紅柿的抗壞血酸含量（p<0.05）.而4個組白利度（表征可溶性固形物含量）影響差異均不顯著（p>0.05），如圖5（c）所示.

圖6為果實品質(zhì)主成分分析（PCA）圖.由圖6可知，橫坐標解釋了33.904%的變異度，縱坐標解釋了26.362%的變異度，具有比較良好的解釋度.施加S3-1的處理組的果實品質(zhì)明顯聚為一類，僅施加LB基質(zhì)的對照組的果實品質(zhì)聚為一類，而施加JD37的處理組與僅施加KMB基質(zhì)的對照組的果實品質(zhì)無法區(qū)分，表明兩者之間的差異并不明顯.因此S3-1能較好地提升西紅柿的果實品質(zhì)，而澆灌LB基質(zhì)也具有一定的促生作用.

2.5 對土壤酶活性的影響

施加 S3-1的處理組在3個月后，與僅施加KMB基質(zhì)的對照組相比，土壤中的脲酶活性（用NH+4 的質(zhì)量分數(shù)表征）顯著降低（p<0.05），但S3-1對蔗糖酶活性（用葡萄糖的質(zhì)量分數(shù)表征）的影響并不顯著（p>0.05），如圖7所示.

3 討 論

IAA是植物體內(nèi)普遍存在的生長激素，該生長激素在一定濃度條件下能夠促進植物的生長發(fā)育[34].而蛋白酶能夠轉(zhuǎn)化土壤中的氮素，使其更易利用.同時，ACC脫氨酶能夠?qū)⒁种浦参锷L的乙烯分解成氨和α-酮丁酸，從而保護植物免受脅迫[35].溶磷能力能夠?qū)⑼寥乐械碾y溶性的磷轉(zhuǎn)換成水溶性磷，從而提升土壤的質(zhì)量[36].鐵在地球上多以難溶性的氧化物形式存在，所以鐵離子的高效獲取對植物的生長至關重要[37].通過測定發(fā)現(xiàn)，S3-1與JD37均具有以上促生能力，且通過對比已有文獻報道系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)兩株菌株也具有非常良好的生物防治潛力.

土壤中微生物數(shù)量的變化率可作為土壤環(huán)境質(zhì)量評價的指標[38].通過田間實驗發(fā)現(xiàn)，更多可培養(yǎng)的細菌與放線菌被根際效應阻擋，說明施加S3-1與JD37增加了西紅柿根際的選擇性.當然這也有可能是由于S3-1與JD37具有較強的定殖能力，從而搶占了其他細菌與放線菌原本的生態(tài)位.兩種菌劑對于真菌數(shù)量變化率的影響并不明顯，其原因可能為兩株菌與真菌均不處于同一生態(tài)位，或者兩者之間的相互關聯(lián)效應較弱.

3個月后，施加S3-1的處理組與對照組相比，西紅柿果實中的可溶性糖、可溶性蛋白、可滴定酸、抗壞血酸的含量分別提升了5%，31%，11%，50%，這與侯樂梅等[39]的研究結(jié)果的趨勢是一致的.說明施加S3-1能夠有效提升西紅柿果實的品質(zhì)，這可能是貝萊斯芽孢桿菌在土壤中的存活能力與抗逆性更強所導致的[40].而僅施加LB培養(yǎng)基的土壤也能略微提升果實品質(zhì)，但效果并不明顯.推測其原因可能是LB培養(yǎng)基也吸引了來自土壤中的芽孢桿菌屬細菌.相較之下，施加JD37的處理組與僅施加KMB培養(yǎng)基的對照組的果實品質(zhì)提升并不顯著，這可能是由于JD37在土壤中的適應性相對較差，而KMB培養(yǎng)基無法吸引土壤中有提升果實品質(zhì)能力的微生物.所以就應用方向而言，貝萊斯芽孢桿菌更適合作為微生物肥料.

酶是土壤或基質(zhì)中生物活性最強的部分，反映了土壤或基質(zhì)中各種生化過程的強度.酶活性可以作為評價土壤或基質(zhì)肥力狀況的生物活性指標[39].曹銀珠等[41]研究表明脲酶的活性較低，可以有效地降低田間氮素的損失.本研究中發(fā)現(xiàn)施加S3-1能顯著地降低土壤中脲酶的活性（p<0.05），所以推測S3-1能夠有效地留存土壤中的氮素，從而提升果實的品質(zhì).而土壤中的蔗糖酶對土壤的碳循環(huán)有顯著影響，但本研究中發(fā)現(xiàn)4組處理組的蔗糖酶活性并沒有顯著性的差異.植物根際的微生物變化率顯示S3-1可能替代了土壤根際中與氮循環(huán)相關的微生物，因此S3-1能抑制土壤中的氮循環(huán)，但對土壤中的碳循環(huán)沒有明顯的抑制作用.

4 結(jié) 論

研究了貝萊斯芽孢桿菌S3-1與桔黃假單胞菌JD37的促生能力，結(jié)果顯示：貝萊斯芽孢桿菌S3-1能夠更有效地提升西紅柿的可溶性糖、可滴定酸、可溶性蛋白等物質(zhì)的含量，也能增加根際可培養(yǎng)微生物的變化率，同時能夠降低土壤的脲酶活性以減少氮素損失.相較于桔黃假單胞菌，貝萊斯芽孢桿菌S3-1有更強的定殖能力搶占生態(tài)位，更穩(wěn)定的產(chǎn)IAA能力，以及通過改變土壤酶活性來提升植物的果實品質(zhì)，更適合作為微生物肥料.

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（責任編輯：顧浩然）