張屾 谷少華 李顯春

摘要以已公布的棉鈴蟲線粒體DNA序列對來自4頭棉鈴蟲雄蛹的DNA的三代測序數(shù)據(jù)進行篩選，獲得了11條與線粒體DNA有同源性的三代read序列，并根據(jù)其中的read 66003鑒定出了一種膨脹的線粒體基因組。該線粒體基因組大小為27 113 bp，其保守區(qū)域包含13個蛋白編碼基因、2個rRNA基因、22個tRNA基因以及1個AT富集區(qū)，與已公布的棉鈴蟲線粒體基因組的結(jié)構(gòu)相似。膨脹區(qū)域位于cox1基因編碼區(qū)內(nèi)部，大小為11 467 bp，經(jīng)預(yù)測含有一個完整的真核基因（依賴ATP的RNA解旋酶）以及多種轉(zhuǎn)座元件的片段，但與線粒體DNA無同源性，也無I類或Ⅱ類內(nèi)含子存在的證據(jù)。對田間和室內(nèi)棉鈴蟲DNA樣品的PCR擴增未能檢測到膨脹線粒體基因組的存在。以上結(jié)果表明膨脹片段可能是細胞核DNA序列通過偶然的水平轉(zhuǎn)移事件而整合到線粒體基因組中的，且該種膨脹方式的發(fā)生概率極低。本文報道的膨脹線粒體基因組為日后動物線粒體基因組學(xué)的研究提示了一種獨特的變異方式。

關(guān)鍵詞棉鈴蟲;線粒體基因組;膨脹;RNA解旋酶;轉(zhuǎn)座子

中圖分類號：S 435.622

文獻標(biāo)識碼：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2018223

線粒體是真核細胞中一種最基本的細胞器，一般認(rèn)為其起源于細菌在真核細胞中的內(nèi)共生作用[1]，且保留了一套獨立于細胞核基因組之外的遺傳系統(tǒng)，能夠進行自我復(fù)制和表達。在植物和動物中，盡管線粒體承擔(dān)的生物學(xué)功能相似，但其基因組卻向兩個極端對立的方向演化：植物線粒體基因組復(fù)雜、龐大，變異程度較大，富含大量非編碼序列和內(nèi)含子;而動物的線粒體基因組較為保守，基因排布緊湊，非編碼區(qū)含量較少，一般不含內(nèi)含子[2]。動物線粒體基因組大小通常在15～20 kb之間，包含13個蛋白編碼基因、22個轉(zhuǎn)運RNA（tRNA）基因、2個核糖體RNA（rRNA）基因和1個AT富集區(qū)（控制區(qū)）[3]。盡管動物線粒體基因組在基因組成和結(jié)構(gòu)上的保守性較高，但變異事件亦會偶爾發(fā)生，主要表現(xiàn)為基因的復(fù)制或缺失、基因重排以及非編碼區(qū)的擴張或收縮等方式。

基因的復(fù)制或缺失是動物中相對常見的線粒體基因組變異方式。例如，某些腔腸動物及箭蟲的線粒體基因組中缺失了幾個乃至全部的tRNA基因[45]，在蛛形綱部分物種和癭蚊類昆蟲的線粒體基因組中則存在tRNA縮短的現(xiàn)象[67]，而基因復(fù)制現(xiàn)象在螨、薊馬乃至脊椎動物的線粒體基因組中均有發(fā)現(xiàn)[810]。

進一步地，線粒體基因復(fù)制和缺失事件的積累可能導(dǎo)致基因重排現(xiàn)象的產(chǎn)生[11]。邱忠營[12]對153種直翅目昆蟲的線粒體基因組進行了比較基因組學(xué)分析，總結(jié)了其中12個物種的基因重排模式，其重排事件發(fā)生的概率較低，且多數(shù)為tRNA基因位置的顛換。線粒體基因重排極端化的一種表現(xiàn)是線粒體的片段化。鞭毛蟲、水母和虱目等的線粒體中均發(fā)現(xiàn)了片段化的現(xiàn)象，最典型的例子是體虱Pediculus humanus，其線粒體基因組由18個微型染色體（minichromosome）組成，每個染色體長3～4 kb，攜帶1～3個基因及一個控制區(qū)[1315]。

線粒體基因組非編碼區(qū)的變異主要源自內(nèi)含子或重復(fù)元件的復(fù)制或丟失。線粒體基因組中的內(nèi)含子分為Ⅰ類內(nèi)含子（group Ⅰ intron）和Ⅱ類內(nèi)含子（group Ⅱ intron）兩類，二者不同于真核細胞核基因組內(nèi)的剪接體內(nèi)含子，它們具備核酶的催化功能，能夠在不依賴剪接體的情況下完成自我剪接[1618]。Ⅰ類內(nèi)含子多見于真菌線粒體，而Ⅱ類內(nèi)含子則為植物線粒體基因組內(nèi)含子的主要形式。內(nèi)含子在動物線粒體中較為罕見，目前僅在?？?、珊瑚等低等后生動物中有報道。Beagley等[4，19]在繡球?？鸐etridium senile線粒體細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ（cox1）和NADH脫氫酶亞基5（ND5）編碼基因內(nèi)部分別發(fā)現(xiàn)了一個Ⅰ類內(nèi)含子，其中前者能夠自我成環(huán)并編碼一個核酸內(nèi)切酶，而后者內(nèi)部則含有編碼ND1和ND3的基因，且內(nèi)含子自我剪接后二者能夠以雙順反子的形式進行轉(zhuǎn)錄。進一步的研究表明，線粒體ND5內(nèi)含子在六射珊瑚綱的物種內(nèi)普遍存在，且其內(nèi)部的蛋白編碼基因復(fù)制數(shù)目在演化中逐步增加[20]。

相較于內(nèi)含子，控制區(qū)或其他重復(fù)序列的變異在動物線粒體基因組中更常見且形式更豐富。Tang等[21]在寄生線蟲Thaumamermis cosgrovei中鑒定出兩種線粒體基因型，其差異源于基因或非編碼區(qū)的變異。軟體動物線粒體基因組的非編碼序列的擴張最為普遍，且個體間差異明顯。深海扇貝Placopecten magellanicus線粒體基因組的大小從30.7 kb至40.7 kb不等，基因組內(nèi)有3個位點存在結(jié)構(gòu)變異，每個位點至少存在6種不同形式的重復(fù)元件，導(dǎo)致了線粒體基因組在個體間的巨大變異[2224]。類似地，在另一種扇貝Pecten maximus的線粒體基因組中存在一類拷貝數(shù)可變的長約1.6 kb的重復(fù)元件，其重復(fù)次數(shù)的不同致使基因組大小在20.0 kb到25.8 kb之間波動[25]。赤貝Scapharca broughtonii的線粒體基因組大小約為50 kb，是后生動物中已知最長的線粒體DNA，其基因組內(nèi)含有一個串聯(lián)重復(fù)單元以及一個可復(fù)制的非編碼區(qū)，二者的變異是基因組擴張的原因[26]。Raimond等[27]利用RFLP技術(shù)測定了鼠婦Armadillidium vulgare的線粒體基因組大?。?0～42 kb），結(jié)合電鏡觀察提出一種膨脹的線粒體基因組的存在形式：約14 kb的線粒體DNA單體發(fā)生復(fù)制和重排形成3個單體，其中一個以線性形式存在，另外兩個則連接成環(huán)。Boyce等[28]在3種象甲Pissodes spp.的線粒體DNA中發(fā)現(xiàn)了擴張的AT富集區(qū)（9～13 kb），同時在其側(cè)翼還存在數(shù)目不等的重復(fù)元件，這成為該屬昆蟲線粒體基因組變異的原因。綜上所述，動物線粒體在基因組成和結(jié)構(gòu)上相對保守，變異事件形式有限、發(fā)生概率較小，其中基因重排和內(nèi)含子插入事件多為可遺傳的，已成為物種固定的遺傳屬性，而重復(fù)元件的變異通常存在多樣性和隨機性，在物種內(nèi)個體間存在差異。

棉鈴蟲Helicoverpa armigera屬鱗翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae，是世界范圍內(nèi)的一種重要農(nóng)業(yè)害蟲，其線粒體基因組已在2010年公布，總長度為15 347 bp，具備典型的動物線粒體基因組結(jié)構(gòu)[29]。本文利用三代DNA測序技術(shù)，鑒定出一條異常的棉鈴蟲線粒體DNA序列，其cox1基因內(nèi)部插入了一段11 467 bp的疑似核基因組的片段，導(dǎo)致線粒體基因組顯著膨脹，為動物線粒體基因組學(xué)的研究提示了一種特殊的變異方式。

1材料與方法

1.1樣品及數(shù)據(jù)來源

棉鈴蟲線粒體基因組序列獲取自二代和三代全基因組DNA測序read。DNA樣品來自4頭蛹期的棉鈴蟲，對其進行全基因組DNA抽提和建庫測序。二代測序平臺為Illumina Hiseq 2000，三代測序平臺為PacBio SMART RS Ⅱ。原始測序數(shù)據(jù)下機后經(jīng)過質(zhì)量控制和融合，以二代數(shù)據(jù)對三代數(shù)據(jù)進行校正，校正后的數(shù)據(jù)用于篩選線粒體相關(guān)的read序列。

1.2線粒體基因組的注釋

線粒體基因組首先以在線工具MFannot和RNAweasel[16]（http：∥megasun.bch.umontreal.ca/RNAweasel/）進行蛋白編碼基因、rRNA基因以及tRNA基因的預(yù)測，隨后從Yin等[29]的報道中提取注釋信息，將之補充并整合到上述預(yù)測結(jié)果中，得到最終的線粒體注釋結(jié)果。線粒體基因組結(jié)構(gòu)圖的繪制使用在線工具CGView Server V 1.0[30]（http：∥stothard.afns.ualberta.ca/cgview_server/）。

1.3線粒體膨脹區(qū)域的分析

膨脹區(qū)域的分析通過BLASTn和BLASTx分別在NCBI的Nucleotide collection（Nt）和Nonredundent（Nr）數(shù)據(jù)庫中進行檢索?；蚪Y(jié)構(gòu)的作圖使用在線工具Gene Structure Display Server 2.0[31]（http：∥gsds.cbi.pku.edu.cn/）。轉(zhuǎn)座元件的預(yù)測使用Repbase數(shù)據(jù)庫中的在線工具CENSOR[32]（https：∥www.girinst.org/censor/）。I 類或Ⅱ類內(nèi)含子的預(yù)測采用RNAweasel。

2結(jié)果與分析

2.1棉鈴蟲膨脹線粒體DNA的鑒定

以已公布的棉鈴蟲線粒體基因組序列（GenBank登錄號GU188273）作為query序列，檢索校正后的三代read，從中篩選出11條與線粒體DNA有同源性的read序列（表1）。序列比對結(jié)果顯示，11條read中有8條對query的覆蓋度較低（<60%），而另外3條超過90%，其中，僅有read 66003完整覆蓋線粒體基因組且首尾存在重疊，由此得到了一條膨脹的環(huán)狀線粒體DNA序列用于后續(xù)分析。

2.2棉鈴蟲膨脹線粒體基因組的注釋

膨脹的棉鈴蟲線粒體基因組大小為27 113 bp，其基因組結(jié)構(gòu)如圖1所示。與已公布的棉鈴蟲線粒體基因組的比對結(jié)果顯示，膨脹線粒體基因組可分為保守區(qū)域和膨脹區(qū)域兩部分。保守區(qū)域中二者核苷酸序列相似度達到97%。通過注釋，在保守區(qū)域鑒定出了13個蛋白編碼基因（cox1，cox2，cox3，cob，nad1，nad2，nad3，nad4，nad4L，nad5，nad6，atp6，atp8）、2個rRNA基因（rnaL，rnaS）、22個tRNA基因（亮氨酸t(yī)RNA和絲氨酸t(yī)RNA分別有2個拷貝，其余18種氨基酸分別對應(yīng)1個tRNA）以及1個AT富集區(qū)。其基因組成和排布方式與已公布的棉鈴蟲線粒體基因組基本一致，不同之處在于cox1基因被打斷為兩部分且缺失了約23 bp的編碼序列。膨脹區(qū)域是一個連續(xù)的、長度為11 467 bp的片段，與正常線粒體無同源性，存在于cox1基因編碼區(qū)之中。

2.3棉鈴蟲線粒體基因組膨脹區(qū)域的分析

蛋白編碼基因檢索的結(jié)果顯示，膨脹區(qū)域內(nèi)包含一個依賴ATP的RNA解旋酶基因（ATPdependent RNA helicase，GenBank登錄號XM_021342945）。該基因具有真核基因的結(jié)構(gòu)，編碼區(qū)位于輕鏈的3 931-10 784 bp區(qū)間，包含5個外顯子，基因結(jié)構(gòu)圖如圖2所示。

NCBI Nt數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果顯示，與膨脹區(qū)域匹配度最高的subject為棉鈴蟲細菌人工染色體（bacterial artificial chromosome，BAC）序列（GenBank登錄號FO082297）。進一步地，使用Repbase預(yù)測膨脹區(qū)域轉(zhuǎn)座元件，結(jié)果如表2所示。其中較完整的一個元件注釋為非長末端重復(fù)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（Non long terminal repeat retrotransposable element，NonLTR/RTE）RTE5，在基因組中分為4個片段，總長度約2 800 bp，其主要部分位于膨脹區(qū)域的6 500-8 800 bp之間，即RNA解旋酶基因第三個內(nèi)含子內(nèi)部。其他轉(zhuǎn)座元件還涉及多種DNA轉(zhuǎn)座子、LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子以及散布重復(fù)序列等，但均不超過1 kb，不具備完整的轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)。此外，內(nèi)含子預(yù)測的結(jié)果顯示，膨脹區(qū)域內(nèi)既不含有I 類/Ⅱ類內(nèi)含子的保守結(jié)構(gòu)，也沒有編碼逆轉(zhuǎn)錄酶或核酸內(nèi)切酶的基因，無法找到內(nèi)含子存在的證據(jù)。

3討論

本文從棉鈴蟲全基因組三代測序原始數(shù)據(jù)中，篩選得到了與線粒體相關(guān)的序列。其中，read 99261和read 119177的read覆蓋度為100%，表明二者可能是正常線粒體DNA的片段;read 66003完整覆蓋subject，且在二代測序數(shù)據(jù)的輔助下能拼接成環(huán)，因此我們借助該read鑒定出了膨脹的棉鈴蟲線粒體基因組;而其余read對subject的覆蓋度較低或存在片段倒位（表1），由于原始數(shù)據(jù)未經(jīng)過拼接組裝，不存在拼接錯誤，因此我們推測這些序列并非是線粒體源的DNA，而是包含線粒體假基因的核基因組序列。線粒體基因組向核基因組遷移的現(xiàn)象廣泛存在。在動物中，線粒體基因通常以假基因形式存在于核基因組中，分布形式多變[3334]，其中昆蟲基因組中的線粒體假基因已在蚱蜢、蚜蟲、天牛等類別的物種中得到研究[3537]。植物中線粒體DNA遷入核基因組的事件比動物更為普遍，核基因組能獲得線粒體基因并保留其功能[38]，且線粒體基因組能以大片段乃至完整形式插入核基因組[39]。在本研究中，線粒體相關(guān)read的鑒定暗示棉鈴蟲核基因組中可能存在諸多的線粒體假基因，且假基因與真基因的相似度較高，但假基因的種類、拷貝數(shù)以及分布方式等問題尚未明確，仍有待進一步研究。Song等[40]的研究表明，細胞核基因組中的線粒體假基因會干擾DNA條形碼鑒定技術(shù)的準(zhǔn)確性，這也提示我們未來使用DNA條形碼定量檢測棉鈴蟲種群時需注意排除線粒體假基因的干擾。

后生動物線粒體基因組通常編碼37個基因，長度一般不超過20 kb，非編碼序列含量很低。棉鈴蟲線粒體基因組前人已有報道[29]，符合動物線粒體基因組的這些保守特征。本文通過高通量測序發(fā)現(xiàn)了一種不同于該報道的、異常膨脹的棉鈴蟲線粒體基因組，其大小達到27 113 bp。與已公布的序列相比，基因組內(nèi)部發(fā)生了顯著的膨脹，膨脹原因主要是cox1基因編碼區(qū)中間插入了一段11 467 bp的序列。線粒體基因組的膨脹主要通過基因復(fù)制或非編碼區(qū)擴張的方式實現(xiàn)。為此，我們分析了膨脹序列的來源以及該區(qū)域內(nèi)編碼基因、重復(fù)元件或內(nèi)含子存在的可能性。如2.3所述，該片段在NCBI Nt數(shù)據(jù)庫中能夠匹配到棉鈴蟲BAC序列，卻與線粒體DNA無任何匹配，表明其并非線粒體基因組自身的復(fù)制或擴張，而更可能來源于核基因組。通過功能基因的注釋，發(fā)現(xiàn)膨脹區(qū)域包含一個完整的核基因組蛋白編碼基因（依賴ATP的RNA解旋酶），且具有外顯子內(nèi)含子的真核基因結(jié)構(gòu)。這進一步表明膨脹片段可能是一段核基因組序列通過水平轉(zhuǎn)移被整合進線粒體基因組的產(chǎn)物。

I 類內(nèi)含子和Ⅱ類內(nèi)含子不同于核基因組內(nèi)的剪接體內(nèi)含子，二者不依賴復(fù)雜的剪接體即可完成自我剪接，后者通常還具備逆轉(zhuǎn)錄酶、成熟酶或核酸內(nèi)切酶的編碼區(qū)[16]。本研究中，利用核酸內(nèi)切酶、逆轉(zhuǎn)錄酶保守結(jié)構(gòu)域以及內(nèi)含子預(yù)測工具均未在膨脹區(qū)域發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子存在的證據(jù)，這表明棉鈴蟲線粒體基因組的膨脹并非由內(nèi)含子插入導(dǎo)致。我們進一步使用Repbase預(yù)測了膨脹線粒體基因組內(nèi)轉(zhuǎn)座元件存在的可能性。結(jié)果表明，該區(qū)域內(nèi)存在一個較完整的NonLTR類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子以及諸多轉(zhuǎn)座元件的片段。這些轉(zhuǎn)座子序列大多不完整，且呈分散或嵌套分布，因此我們推測膨脹片段的祖先序列經(jīng)歷了多次轉(zhuǎn)座事件，多數(shù)轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)被破壞，僅殘留部分痕跡，而線粒體基因組中該膨脹部分的插入則可能是在上述轉(zhuǎn)座事件后發(fā)生的一次細胞核DNA水平轉(zhuǎn)移事件。

在植物中，核內(nèi)DNA序列、尤其是轉(zhuǎn)座元件整合進入線粒體基因組的現(xiàn)象較為普遍[39]，但在動物線粒體基因組中此類變異事件較為罕見，且對于簡單、緊湊的線粒體基因組，轉(zhuǎn)座子通常是有害的，在演化過程中易受凈化選擇（purifying selection）作用而被清除。針對本文中鑒定得到的棉鈴蟲膨脹線粒體基因組，我們曾嘗試在室內(nèi)及田間收集的數(shù)十個棉鈴蟲DNA樣品中克隆該膨脹區(qū)域，但均未發(fā)現(xiàn)目的片段整合到線粒體基因組的證據(jù)。該膨脹的線粒體基因組序列是直接由DNA測序read得到的，不會摻入拼接錯誤，因此可以保證其存在的真實性，而其克隆證據(jù)的缺失一方面可能是因為膨脹序列的保守性較低，存在諸多變異形式，另一方面，更大的可能性在于此種線粒體膨脹事件發(fā)生的概率極低，且其破壞了cox1基因的編碼區(qū)，對個體生存是不利的，很難被遺傳下去，只是發(fā)生在體細胞的一種偶然突變。盡管如此，本文報道的棉鈴蟲線粒體基因組的膨脹，仍可為日后的研究提示一種特殊的線粒體基因組變異方式。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）