崔婷婷 杜立新 彭琦

摘要本文分別構(gòu)建了cry8E基因上游的啟動子（Porf18E）和其上游缺失orf1基因的啟動子（PΔorf18E）融合lacZ基因的表達(dá)載體，通過β半乳糖苷酶活性的分析，發(fā)現(xiàn)PΔorf18E的轉(zhuǎn)錄活性高于Porf18E。分別用PΔorf18E和Porf18E指導(dǎo)cry1Ac基因的表達(dá)，通過光學(xué)顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)兩個啟動子指導(dǎo)表達(dá)的Cry1Ac蛋白均可形成雙錐形晶體;通過總蛋白定量分析發(fā)現(xiàn)，缺失orf1基因的啟動子（PΔorf18E）指導(dǎo)的Cry1Ac蛋白表達(dá)量高于Porf18E啟動子指導(dǎo)的Cry1Ac蛋白表達(dá)量;生物活性測定表明：PΔorf18E指導(dǎo)的Cry1Ac晶體蛋白對小菜蛾P(guān)lutella xylostella具有殺蟲活性，高于Porf18E指導(dǎo)的Cry1Ac晶體蛋白對小菜蛾的殺蟲活性。本文獲得的強(qiáng)活性的啟動子PΔorf18E是目前已報道的轉(zhuǎn)錄活性最高的cry基因啟動子，該啟動子為Cry蛋白的表達(dá)和遺傳工程菌株構(gòu)建提供了重要元件。

關(guān)鍵詞蘇云金芽胞桿菌;cry基因啟動子;轉(zhuǎn)錄活性;Cry晶體蛋白;晶體蛋白表達(dá)

中圖分類號：S 476.11

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2018138

蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuringiensis，簡稱Bt，是革蘭氏陽性細(xì)菌，屬于蠟樣芽胞桿菌菌族Bacillus cereus group，其在芽胞形成的同時能夠產(chǎn)生對多種農(nóng)林害蟲有殺蟲活性的伴胞晶體，主要由cry或cyt基因編碼。因其對人畜無害、對環(huán)境友好等特性，Bt已被商業(yè)化應(yīng)用，成為世界上應(yīng)用最廣的微生物殺蟲劑[1]。但是Bt殺蟲劑在田間應(yīng)用過程中，Cry蛋白存在持效期短、受紫外照射等環(huán)境因素影響容易降解等缺點(diǎn)，因此提高Cry蛋白的產(chǎn)量和穩(wěn)定性成為Bt遺傳改良的有效策略。目前已報道，cry8E基因的啟動子指導(dǎo)表達(dá)的Cry1Ac蛋白產(chǎn)量高于野生菌株HD73產(chǎn)生的Cry1Ac蛋白[2]。高活性的非cry基因的啟動子也已成功表達(dá)Cry蛋白，如編碼芽胞外壁基層蛋白的exsY基因的啟動子PexsY可正確指導(dǎo)Cry1Ac蛋白的表達(dá)[3];最新的研究表明，Bt HD73_5014基因的啟動子可以高效地指導(dǎo)表達(dá)Cry1Ac蛋白，其表達(dá)的蛋白產(chǎn)量與cry8E啟動子指導(dǎo)表達(dá)的Cry1Ac蛋白產(chǎn)量相當(dāng)[4]。因此，發(fā)掘強(qiáng)活性的啟動子指導(dǎo)Cry蛋白的表達(dá)是一條重要途徑。

cry8E基因和上游基因orf1以操縱子形式成為一個轉(zhuǎn)錄單元，分別受σH和σE調(diào)控[5]，cry8E基因的啟動子Porf1cry8E是目前報道的轉(zhuǎn)錄活性最強(qiáng)的cry基因啟動子[4，6]。本研究在此基礎(chǔ)上，分析了缺失orf1基因的啟動子PΔorf18E的活性;用PΔorf18E啟動子指導(dǎo)表達(dá)Cry1Ac晶體蛋白并檢測其殺蟲活性。PΔorf18E啟動子為Cry蛋白的表達(dá)和遺傳工程菌株構(gòu)建提供了重要元件。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

本試驗中所用菌株與質(zhì)粒見表1。大腸桿菌Escherichia coli的培養(yǎng)使用LB培養(yǎng)基（胰蛋白胨1.0%，酵母提取物0.5%，NaCl 1.0%，pH 7.2）。Bt的培養(yǎng)使用LB培養(yǎng)基和SSM培養(yǎng)基[7]。Bt在30℃、220 r/min條件下培養(yǎng);E. coli在37℃、220 r/min條件下培養(yǎng)，氨芐青霉素使用終濃度為100 μg/mL，紅霉素使用終濃度為5 μg/mL。

1.1.2主要試劑

TaqMix DNA聚合酶購自BioMed;限制性內(nèi)切酶、PrimeStar、T4 DNA連接酶、DH5α感受態(tài)、Solution I購自大連寶生物有限公司;膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自Axygen;無縫克隆試劑盒（Seamless Assembly Cloning Kit）購自中美泰和生物技術(shù)有限公司。

1.1.3引物合成及序列測定

根據(jù)Bt 185菌株[8]和HD73菌株[10]的基因組序列設(shè)計引物，引物合成由上海生工生物工程公司北京合成部完成，引物名稱及序列見表2。序列測定由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1） 下劃線表示酶切位點(diǎn)。

Restriction enzyme sites are underlined.

1.2Porf18E和PΔorf18E啟動子融合lacZ基因表達(dá)載體的構(gòu)建

以Bt185基因組[8]為模板，以Porf15/P8E3為引物擴(kuò)增含有orf1的啟動子、orf1基因和cry8E基因啟動子的片段Porf18E（1 352 bp），PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)PstⅠ和BamHⅠ雙酶切并連接至含有l(wèi)acZ報告基因的pHT30418Z載體Pst Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切片段上，轉(zhuǎn)化E. coli TG1菌株，獲得重組質(zhì)粒pHTPorf18E;以Bt185基因組為模板，分別以Porf15/Porf13和P8E5/P8E3為引物擴(kuò)增orf1的啟動子（Porf1，559 bp）和cry8E基因的啟動子（Pcry8E，280 bp），PCR產(chǎn)物純化后，應(yīng)用無縫克隆試劑盒將Porf1和Pcry8E片段連接至含有l(wèi)acZ報告基因的pHT30418Z載體Pst Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切片段上，轉(zhuǎn)化E. coli TG1菌株，獲得缺失orf1基因的重組質(zhì)粒pHTPΔorf18E。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、酶切和測序鑒定，轉(zhuǎn)化至E. coli ET菌株使質(zhì)粒去甲基化，然后將重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化至Bt HD73菌株，獲得菌株HD（Porf18E18Z）和HD（PΔorf18E18Z）。

1.3β半乳糖苷酶活性分析

分別取500 μL活化過夜的HD（Porf18E18Z）和HD（PΔorf18E18Z）菌株轉(zhuǎn)接到50 mL SSM培養(yǎng)基中，30℃，220 r/min培養(yǎng)至T0時期（T0為對數(shù)生長期結(jié)束時間，Tn為T0后第n小時），每隔1 h取樣1次，每次2 mL，12 000 r/min離心，棄上清，沉淀于-40℃保存?zhèn)溆?。β半乳糖苷酶活性測定方法參考文獻(xiàn)[11]，試驗至少重復(fù)3次。

1.4Porf18E和PΔorf18E啟動子指導(dǎo)Cry1Ac表達(dá)載體的構(gòu)建

分別以pHTPorf18E和pHTPΔorf18E質(zhì)粒為模板，以Porf15/P8E3為引物，擴(kuò)增Porf18E和PΔorf18E片段;以BtHD73基因組為模板，以1ACF和1ACR為引物擴(kuò)增cry1Ac基因（3 537 bp），PCR產(chǎn)物純化后，應(yīng)用無縫克隆試劑盒，分別將Porf18E和cry1Ac兩個片段、PΔorf18E和cry1Ac兩個片段連接至經(jīng)過Hind Ⅲ和EcoRⅠ雙酶切的pHT304載體上，轉(zhuǎn)化E. coli TG1菌株，獲得重組質(zhì)粒pHTPorf18E1Ac和pHTPΔorf18E1Ac。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、酶切和測序鑒定，轉(zhuǎn)化至E. coli ET菌株使質(zhì)粒去甲基化，然后將重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化至Bt HD73-無晶體突變菌株中，獲得菌株HD-（Porf18E1Ac）和HD-（PΔorf18E1Ac）。

1.5顯微鏡觀察

分別取500 μL過夜活化的HD-（Porf18E1Ac）和HD-（PΔorf18E1Ac）菌液轉(zhuǎn)接至50 mL SSM培養(yǎng)基，30℃，220 r/min，培養(yǎng)至T20、T22和T24，取1 mL菌液，12 000 r/min離心1 min，棄上清，沉淀用1 mL的無菌水清洗1次，12 000 r/min離心1 min，棄上清，沉淀用60 μL的水懸浮，吸取1 μL的樣品置于載玻片上，上面覆蓋蓋玻片在100×的油鏡（OLYMPUS，BX61）下觀察菌體形態(tài)。

1.6菌體總蛋白定量

分別取500 μL過夜活化的HD-（Porf18E1Ac）和HD-（PΔorf18E1Ac）菌液轉(zhuǎn)接至50 mL SSM培養(yǎng)基，30℃，220 r/min，培養(yǎng)到細(xì)胞裂解（T24），12 000 r/min離心1 min收集菌體，用水重懸，加入石英砂破碎，混合均勻;樣品與5 ×loading buffer混勻，沸水浴中10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清用 Pierce660 nm Protein Assay Kit 進(jìn)行總蛋白的定量，方法參見Pierce 660 nm Protein Assay Kit 說明書。取總蛋白量一致的樣品SDSPAGE（sodium dodecyl sulphatepolyacrylamide gel electrophoresis）檢測Cry1Ac蛋白，并利用Image J軟件分析Cry1Ac蛋白的表達(dá)量[2]。

1.7生物活性測定

以小菜蛾P(guān)lutella xylostella為試蟲，用于生物活性測定的菌株為HD-（Porf18E1Ac）、HD-（PΔorf18E1Ac）、HD73和HD73-。菌株在SSM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至T24時期，將菌液凍干，取相同生物量的4株菌的凍干粉，用滅菌水稀釋成相同的濃度，分別為：1.25、2.5、5、10、20、40和80 μg/mL;將上述不同濃度的菌液均勻地涂抹于直徑為6 cm的卷心菜葉上，晾干后，置于9 cm的培養(yǎng)皿中;每個培養(yǎng)皿中接種30頭體型相當(dāng)?shù)男〔硕?齡幼蟲。48 h后計算幼蟲成活率和LC50。數(shù)據(jù)獨(dú)立重復(fù)3次。

2結(jié)果與分析

2.1Porf18E和PΔorf18E啟動子活性分析

cry8E基因上游的全長啟動子Porf18E和缺失orf1基因的啟動子PΔorf18E融合lacZ基因的表達(dá)菌株HD（Porf18E18Z）和HD（PΔorf18E18Z）的構(gòu)建流程見圖1a，β半乳糖苷酶活性測定表明，在T0-T3時期，HD（Porf18E18Z）和HD（PΔorf18E18Z）菌株的轉(zhuǎn)錄活性沒有明顯區(qū)別（圖1b），從T4開始到T12，HD（PΔorf18E18Z）菌株的活性明顯高于HD（Porf18E18Z）菌株，說明orf1基因的缺失導(dǎo)致cry8E基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性上升。

2.2Porf18E和PΔorf18E指導(dǎo)Cry1Ac表達(dá)菌株的獲得

缺失orf1基因的啟動子轉(zhuǎn)錄活性PΔorf18E高于全長的Porf18E啟動子轉(zhuǎn)錄活性，為了比較兩個啟動子指導(dǎo)的Cry蛋白的表達(dá)量，構(gòu)建了Porf18E和PΔorf18E指導(dǎo)Cry1Ac表達(dá)載體（詳見方法1.4），構(gòu)建流程見圖2a，將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入HD73-無晶體突變體株，獲得用于表達(dá)Cry1Ac蛋白的菌株HD-（Porf18E1Ac）和HD-（PΔorf18E1Ac）。在cry1Ac基因內(nèi)部設(shè)計3′端引物（8E1AcR），在Porf1片段上游設(shè)計5′端引物（8E1AcR），經(jīng)PCR鑒定（圖2b），以HD-（Porf18E1Ac）菌株為模板，擴(kuò)增得到1 104 bp的片段;以HD-（PΔorf18E1Ac）菌株為模板，擴(kuò)增得到681 bp的片段，兩個PCR產(chǎn)物大小相差423 bp，與缺失的orf1基因的大小一致，說明菌株構(gòu)建正確。

2.3Cry1Ac晶體形態(tài)學(xué)觀察

在光學(xué)顯微鏡下觀察HD-（Porf18E1Ac）和HD-（PΔorf18E1Ac）菌株產(chǎn)生的Cry1Ac晶體蛋白形態(tài)，以野生型HD73和無晶體突變株HD73-作為對照，結(jié)果（圖3）表明，在T20、T22、T24這3個時期，HD-（Porf18E1Ac）和HD-（PΔorf18E1Ac）菌株均可以正常表達(dá)Cry1Ac晶體蛋白，與野生型HD73一樣，形成雙錐形晶體蛋白，而HD73-菌株無晶體蛋白產(chǎn)生。說明Porf18E和PΔorf18E均可指導(dǎo)表達(dá)Cry1Ac蛋白。

2.4菌體Cry1Ac晶體蛋白產(chǎn)量分析

為了比較Porf18E和PΔorf18E指導(dǎo)表達(dá)的Cry1Ac蛋白產(chǎn)量，以HD73為陽性對照，HD73-為陰性對照，應(yīng)用Pierce660 nm Protein Assay Kit對HD-（Porf18E1Ac）和HD-（PΔorf18E1Ac）菌株進(jìn)行總蛋白定量，取相同量的總蛋白進(jìn)行SDSPAGE檢測，結(jié)果表明（圖4），HD-（Porf18E1Ac）和HD-（PΔorf18E1Ac）菌株均可表達(dá)出約130 kD的Cry1Ac蛋白，而HD73-無晶體突變體無蛋白表達(dá);利用Image J軟件分析Cry1Ac蛋白的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)在總蛋白量相同的條件下，HD-（PΔorf18E1Ac）菌株表達(dá)的Cry1Ac的量約為HD-（Porf18E1Ac）菌株的1.5倍，這與PΔorf18E和Porf18E啟動子的酶活數(shù)據(jù)趨勢相一致（圖1b），說明強(qiáng)活性的PΔorf18E啟動子，指導(dǎo)表達(dá)的Cry1Ac蛋白的產(chǎn)量也提高。

2.5生物活性分析

為了比較Porf18E和PΔorf18E指導(dǎo)表達(dá)的Cry1Ac蛋白的活性，選取相同生物量的HD-（Porf18E1Ac）和HD-（PΔorf18E1Ac）菌株對小菜蛾P(guān)lutella xylostella幼蟲進(jìn)行生物活性測定，以HD73為陽性對照，HD73-為陰性對照。接種幼蟲48 h后計算成活率，并計算LC50，結(jié)果表明（表3）HD-（PΔorf18E1Ac）菌株對小菜蛾的殺蟲活性最高，說明缺失orf1基因的啟動子PΔorf18E指導(dǎo)表達(dá)Cry1Ac蛋白的菌株具有較高的殺蟲活性，這與啟動子酶活結(jié)果（圖1b）和Cry1Ac蛋白表達(dá)量結(jié)果（圖4）一致。

3討論

前期研究中，通過比較不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的cry1Ac、cry3A、cry4A和cry8E基因的啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄活性由高到低依次為：Pcry8E>P1Ac>Pcry4A>Pcry3A[2，6，12]。cry8E基因的啟動子Pcry8E可以正確地指導(dǎo)Cry1Ac的表達(dá)，并且可以形成雙錐形晶體，同時對小菜蛾有殺蟲活性[2，12]。本研究發(fā)現(xiàn)，缺失orf1基因的啟動子PΔorf18E的轉(zhuǎn)錄活性高于已報道的最高活性的cry基因啟動子Porf1cry8E，因此PΔorf18E啟動子是目前發(fā)現(xiàn)的最高活性的cry基因的啟動子。PΔorf18E可正確指導(dǎo)表達(dá)Cry1Ac蛋白，并具有殺蟲活性，該啟動子可用于構(gòu)建高效表達(dá)載體，從而實現(xiàn)殺蟲蛋白的高效表達(dá)，在研制更為高效廣譜的蘇云金芽胞桿菌工程菌中發(fā)揮重要的作用。

蘇云金芽胞桿菌在表達(dá)大量的殺蟲晶體蛋白的同時還表達(dá)一些小分子量蛋白質(zhì)，它們自身不具有殺蟲活性，但可以影響某些殺蟲晶體蛋白的表達(dá)和晶體形成。這些cry基因通常與這些小分子量蛋白基因組成轉(zhuǎn)錄單元共同轉(zhuǎn)錄[13]。這些小分子量蛋白本身沒有殺蟲活性，不是伴胞晶體的主要成分，但對某些殺蟲晶體蛋白的正常表達(dá)或晶體形成有促進(jìn)作用，甚至是必需的，因此被稱為輔助蛋白（accessory protein）。目前已知的輔助蛋白主要有5個，即cry11Aa操縱子中的P19和P20[14];cry2Aa操縱子中的ORF1和ORF2[15];以及cry19A 轉(zhuǎn)錄單元下游orf2 編碼的60 kD蛋白（ORF260k）[13]。P19對cry11A基因的表達(dá)略有幫助;P20作為分子伴侶能夠促進(jìn)多種Bt殺蟲晶體蛋白的產(chǎn)量和/或晶體形成[16];而ORF1 對晶體蛋白產(chǎn)量或蛋白晶體化的影響尚不明確。ORF2和ORF260k蛋白對于Cry2A 和Cry19A的晶體形成是必需的[13，17]。此外，cry6Aa2基因下游的ORF2蛋白對其表達(dá)存在負(fù)調(diào)控作用，但作用機(jī)制尚不明確[18]。本研究中的cry8E操縱子中orf1基因編碼的ORF1氨基酸序列，與cry9Ec1基因操縱子中的ORF1相似性為66%;與cry9Ca1基因操縱子中的ORF1相似性為65%;與cry2A基因操縱子中的ORF1具有64%的相似性;與cry11A操縱子中的第一個orf—P19有40%的相似性;與Cry18A操縱子中ORF1具有39%的相似性。轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究表明，orf1基因缺失導(dǎo)致cry8E基因啟動子PΔorf18E的轉(zhuǎn)錄活性上升，同時可以提高Cry1Ac蛋白的表達(dá)量，這些結(jié)果與前人報道的關(guān)于輔助蛋白p19基因和orf1基因的功能是不同的，說明cry8E操縱子中的ORF1存在一種新的功能，可能對cry8E基因的轉(zhuǎn)錄存在調(diào)控功能，但其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1]SCHNEPF E， CRICKMORE N V， VAN RIE J， et al. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins [J].Microbiology and Molecular Biology Reviews，1998，62（3）：775806.

[2]李朝睿，杜立新，彭琦，等.蘇云金芽胞桿菌高效表達(dá)載體的構(gòu)建[J].微生物學(xué)通報，2013，40（2）：350361.

[3]鄭慶云，王冠男，張喆，等.芽胞外壁基質(zhì)組成蛋白的編碼基因啟動子PexsY指導(dǎo)的cry1Ac基因表達(dá)[J].微生物學(xué)報，2014，10：005.

[4]ZHANG Xin， GAO Tantan， PENG Qi， et al. A strong promoter of a noncry gene directs expression of the cry1Ac gene in Bacillus thuringiensis[J]. Applied Microbiology and Biotechnology， 2018，102（8）：36873699.

[5]DU Lixin， QIU Lili， PENG Qi， et al. Identification of the promoter in the intergenic region between orf1 and cry8Ea1 controlled by sigma H factor [J]. Applied and Environmental Microbiology， 2012， 78（12）： 41644168.

[6]ZHOU Changmei， ZHENG Qinyun， PENG Qi， et al. Screening of crytype promoters with strong activity and application in Cry protein encapsulation in a sigK mutant [J]. Applied Microbiology and Biotechnology， 2014， 98（18）： 79017909.

[7]SCHAEFFER P， MILLET J， AUBERT J P. Catabolic repression of bacterial sporulation [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 1965， 54（3）： 704711.

[8]SHU Changlong， YU Hong， WANG Rongyan， et al. Characterization of two novel cry8 genes from Bacillus thuringiensis strain BT185 [J].Current Microbiology，2009，58（4）：389392.

[9]AGAISSE H， LERECLUS D. Structural and functional analysis of the promoter region involved in full expression of the cryIIIA toxin gene of Bacillus thuringiensis[J]. Molecular Microbiology， 1994， 13（1）： 97107.

[10]LIU Guiming， SONG Lai， SHU Changlong， et al. Complete genome sequence of Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki strain HD73 [J]. Genome Announcements，2013，1（2）：e0008013.

[11]PERCHAT S， DUBOIS T， ZOUHIR S， et al. A cellcell communication system regulates protease production during sporulation in bacteria of the Bacillus cereus group [J]. Molecular Microbiology， 2011， 82（3）： 619633.

[12]王新梅，杜立新，彭琦，等.四種cry基因啟動子在spoIIID基因突變株中的活性比較[J].微生物學(xué)報，2012，52（9）：10751084.

[13]BARBOZACORONA J E， PARK H W， BIDESHI D K， et al. The 60kilodalton protein encoded by orf2 in the cry19A operon of Bacillus thuringiensis subsp. jegathesan functions like a Cterminal crystallization domain[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2012， 78（6）： 20052012.

[14]DERVYN E， PONCET S， KLIER A， et al. Transcriptional regulation of the cryIVD gene operon from Bacillus thuringiensis subsp. israelensis[J]. Journal of Bacteriology， 1995， 177（9）： 22832291.

[15]WIDNER W R， WHITELEY H R. Two highly related insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki possess different host range specificities [J]. Journal of Bacteriology， 1989， 171（2）： 965974.

[16]DENG Chao， PENG Qi， SONG Fuping， et al. Regulation of cry gene expression in Bacillus thuringiensis[J]. Toxins， 2014， 6（7）： 21942209.

[17]STAPLES N， ELLAR D， CRICKMORE N. Cellular localization and characterization of the Bacillus thuringiensis Orf2 crystallization factor [J]. Current Microbiology， 2001， 42（6）： 388392.

[18]YU Ziquan， BAI Peisheng， YE Weixing， et al. A novel negative regulatory factor for nematicidal Cry protein gene expression in Bacillus thuringiensis [J]. Journal of Microbiology and Biotechnology，2008，18（6）：10331039.

（責(zé)任編輯：田喆）