沈陽 洪旭 呂文剛 等

摘要 [目的]對侵染蝴蝶蘭和文心蘭的辣椒褪綠病毒進(jìn)行田間調(diào)查，并進(jìn)行分子鑒定，為廣東順德花卉順利出口提供技術(shù)支持和把關(guān)服務(wù)。[方法]根據(jù)辣椒褪綠病毒的一對特異性引物核殼體（nucleocapsid，N）基因，應(yīng)用RT-PCR檢測方法對2種蘭花疑似感染病毒的植株進(jìn)行分子鑒定。[結(jié)果]蝴蝶蘭（樣品編號2、3、5和10）和文心蘭（樣品編號6）感染辣椒褪綠病毒，系統(tǒng)進(jìn)化樹表明2種蘭花感染的辣椒褪綠病毒與該病毒泰國分離物以較高的后驗概率聚為同一類群。[結(jié)論]辣椒褪綠病毒已在廣東順德的蝴蝶蘭和文心蘭上發(fā)生危害，且文心蘭感染辣椒褪綠病毒為國內(nèi)首次報道，出口企業(yè)需加強(qiáng)檢疫監(jiān)控工作。

關(guān)鍵詞 蝴蝶蘭;文心蘭;辣椒褪綠病毒;鑒定

中圖分類號 S41文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）04-0117-03

Abstract [Objective]Field investigation and molecular identification of CaCV infected with Phalaenopsis and Oncidium were conducted， to provide technical supports and security services for the smooth export of flowers in Shunde， Guangdong. [Method]Based on the nucleocapsid （N） gene of a pair of specific primers of CaCV， the two species of orchids with suspected virus infection were identified by RTPCR. [Result] Phalaenopsis （sample No. 2， 3， 5 and 10） and Oncidium （sample No. 6） were infected with CaCV. Phylogenetic tree showed that the two orchids infected with CaCV and the Thai isolate of the virus were clustered into the same group with higher posterior probability. [Conclusion]Capiscum chlorosis virus has been harmful in Phalaenopsis and Oncidium in Shunde， Guangdong Province， the infection of Oncidium with CaCV is the first reported in China. Export enterprises need to strengthen quarantining and monitoring work.

Key words Phalaenopsis;Oncidium;CaCV;Identification

蝴蝶蘭（Phalaenopsis sp）能開出形如蝴蝶飛舞般的花朵，深受花迷們的青睞，素有“洋蘭王后”之稱。文心蘭（Oncidium sp）花朵奇異可愛，形似飛翔的金蝶，極富動感，是世界重要的盆花和切花種類之一，又稱“吉祥蘭”。然而，近年來隨著蘭花國內(nèi)外貿(mào)易和種質(zhì)交流頻率的增加，蘭花病毒病的發(fā)生有蔓延趨勢，對蘭花產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生了嚴(yán)重影響。目前，至少有57種病毒可感染蘭科植物[1]。2008年，中國臺灣地區(qū)首次報道辣椒褪綠病毒（Capiscum chlorosis virus，CaCV）侵染蝴蝶蘭品種[2]，國內(nèi)僅有辣椒褪綠病毒侵染蝴蝶蘭的報道[3-4]，鮮見該病毒侵染文心蘭的文獻(xiàn)報道。廣東順德，素稱“千年花鄉(xiāng)”，被業(yè)內(nèi)稱為花卉業(yè)的“圣地”，2015年成功創(chuàng)建國家級出口種苗花卉質(zhì)量安全示范區(qū)，區(qū)內(nèi)種植及出口花卉種類繁多，品質(zhì)優(yōu)良，特別是蝴蝶蘭、文心蘭等蘭花出口量排全國前列。為了有效地應(yīng)對進(jìn)口國對順德出口蘭花的植物檢疫措施，應(yīng)盡早檢出感病蘭花植株并實施銷毀，避免蘭花出口受到影響。筆者根據(jù)辣椒褪綠病毒的一對特異性引物核殼體（nucleocapsid，N）基因，應(yīng)用RT-PCR檢測方法鑒定侵染蝴蝶蘭和文心蘭的辣椒褪綠病毒，以期為出口花卉企業(yè)提供技術(shù)支持和保障。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疑似病株樣品的采集。于2018年4—8月，先后4次在順德多家花卉種植基地開展了蝴蝶蘭、文心蘭的病毒病害調(diào)查，采用田間調(diào)查與訪問有經(jīng)驗的花農(nóng)等形式相結(jié)合。選取普查點(diǎn)，覆蓋調(diào)查點(diǎn)面積的80%以上。采用2種調(diào)查方法：①簡單隨機(jī)取樣法，利用隨機(jī)數(shù)字表或非主觀地抽取一個隨機(jī)樣本，適用于有害生物分布比較均勻的地塊;②系統(tǒng)取樣法（順序取樣法），在調(diào)查區(qū)內(nèi)按一定的間隔抽取一個取樣單位，包括等距離平行取樣、對角線取樣等。常采用五點(diǎn)取樣法，每點(diǎn)不少于20株。采集具有疑似病毒病癥狀的蝴蝶蘭和文心蘭全株或部分組織，主要是植株葉片，詳細(xì)記錄病害發(fā)生部位和危害程度，系統(tǒng)描述病害發(fā)生的癥狀。拍攝照片，并將感病標(biāo)本攜回實驗室進(jìn)行進(jìn)一步處理與病原鑒定。

1.1.2 材料。RNA及DNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒、PCR試劑和DNA Marker均購于美津生物技術(shù)公司;其他生化和普通化學(xué)試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 方法

1.2.1 核酸抽提。采用RNAprep pure植物總RNA提取試劑盒，依照產(chǎn)品說明書所示步驟抽提樣品總RNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。利用常?guī)的CTAB法對樣品進(jìn)行總DNA抽提[5-6]，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病毒引物的設(shè)計。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫CaCV的核殼體蛋白基因的保守序列分別設(shè)計引物。上游引物ac-1：5′-AGAGCAATCGGGGC-3′，下游引物ac-2：5′-GTTCTAGCAAAAGCACCT-3′，預(yù)計擴(kuò)增產(chǎn)物864 bp。

1.2.3 RT-PCR和PCR擴(kuò)增及電泳觀察。以感病組織總RNA為模板，采用RT-PCR試劑盒提供的一步法進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察擴(kuò)增結(jié)果。

RT-PCR擴(kuò)增程序如下：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min，94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。

1.2.4 測序結(jié)果分析。對電泳目的條帶切割回收，送北京奧科生物技術(shù)公司進(jìn)行測序。登錄NCBI官網(wǎng)，將測序結(jié)果輸入BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）進(jìn)行相似性比對。根據(jù)相似性確定病毒種類，再進(jìn)一步利用Mega5.1軟件對核苷酸序列進(jìn)行多序列分析比較和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝴蝶蘭和文心蘭病毒病危害癥狀

由圖1可知，疑似感染病毒病的2種蘭花病害癥狀主要表現(xiàn)在葉片，一般在葉片上出現(xiàn)斑駁、花葉、壞死或斑點(diǎn)，少量植株表現(xiàn)為無癥狀，初步統(tǒng)計發(fā)病率約為10%。

2.2 蝴蝶蘭與文心蘭病毒種類的分子檢測

以反轉(zhuǎn)錄得到的總DNA為模板，將圖1疑似感病的全部樣品用CaCV的特異性引物核殼體基因進(jìn)行PCR檢測，從表現(xiàn)典型癥狀的蝴蝶蘭（樣品編號2、3、5和10）和文心蘭（樣品編號6）中擴(kuò)增得到大小為864 bp左右的條帶，與感染CaCV的陽性對照擴(kuò)增結(jié)果一致（圖2）。結(jié)果表明采集的蝴蝶蘭和文心蘭的上述5個樣品可能被CaCV侵染危害，2種蘭花的其他疑似感病植株未被CaCV侵染。

2.3 蝴蝶蘭與文心蘭CaCV順德分離物部分序列分析

將PCR擴(kuò)增獲得的約864 bp的片段進(jìn)行純化，并對電泳目的條帶切割回收和測序。經(jīng)BLAST程序nucleotide blast進(jìn)行序列相似性檢索和分析，結(jié)果表明檢測為陽性的順德2種蘭花5個樣品得到的病毒基因組部分序列與GenBank中CaCV泰國分離物（登錄號FJ947156.1）同源率最高，為98%～99%。由圖3可知，順德2種蘭花的5個樣品確認(rèn)感染CaCV，并且與CaCV泰國分離物以較高的后驗概率聚為同一類群。序列聚類結(jié)果表明，在廣東順德蝴蝶蘭和文心蘭上發(fā)現(xiàn)的CaCV可能是由泰國傳過來的。

3 結(jié)論與討論

2017年，國際病毒分類委員會（ICTV）將布尼亞病毒科（Bunyaviridae）的番茄斑萎病毒屬歸類到新增的番茄斑萎病毒科（Tospoviridae），屬名由Tospovirus改為Orthotospovirus，該屬現(xiàn)有11個確定種[7]，CaCV是西瓜銀斑駁病毒（Watermelon silver mottle virus，WSMoV）的一個株系[8]，該病毒在蝴蝶蘭和文心蘭的傳播途徑為薊馬傳播或無性繁殖傳播[9-10]。Orthotospovirus病毒引起植物病害癥狀主要有壞死、褪綠、黃化環(huán)形病斑、銀色、局部枯斑、矮化和斑駁。從癥狀表現(xiàn)看，在蝴蝶蘭和文心蘭上主要表現(xiàn)為斑駁、花葉、壞死或斑點(diǎn)等典型癥狀。

蝴蝶蘭和文心蘭感染CaCV后，觀賞價值受到影響，甚至不能順利出口，對于以出口為導(dǎo)向的順德花卉種植企業(yè)尤為重要。目前在危害蘭花的各類病害中，生物防治和化學(xué)防治對病毒病仍然無大的效果，因此對蘭花病毒病的預(yù)防顯得極為重要。

目前主要從以下幾個方面對蘭花的病毒病進(jìn)行綜合防治：①培育無毒種苗，大量種植無毒蘭花種苗并采取有效的防護(hù)措施使種苗不被病毒侵染，從而繁育、生產(chǎn)無毒小苗;②加強(qiáng)植物檢疫工作，從目前國內(nèi)發(fā)現(xiàn)的蘭花病毒基因序列分析結(jié)果可知，CyMV和ORSV分離物與荷蘭、韓國、日本等地的分離物同源性很高[11]，因此加強(qiáng)口岸檢疫意義重大;③加強(qiáng)對蘭花種植基地蚜蟲、飛虱、葉蟬、螨類和線蟲等有害生物綜合防治工作，這幾類有害生物是傳播病毒病的重要媒介生物，其能夠?qū)⑵渌参锏牟《静魅镜教m花，造成蘭花病毒病的蔓延擴(kuò)散;④定期清園，銷毀病葉、雜草、老葉等潛在病毒載體，對外人進(jìn)入種植場所進(jìn)行嚴(yán)格限制，降低將外界病毒帶入蘭花種植場的風(fēng)險;⑤加強(qiáng)農(nóng)業(yè)栽培措施，適當(dāng)降低蘭花種植密度，例如CymMV可以通過汁液傳播，盡可能避免蘭花植株葉片間的相互重疊和摩擦損傷，以減少病毒通過葉片傷口交叉感染[12]。

筆者通過核酸提取、PCR擴(kuò)增、基因序列分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定了CaCV侵染廣東順德蝴蝶蘭和文心蘭這2種蘭花品種，為花卉種植企業(yè)有效鑒別染病蘭花植株提供技術(shù)支持，并為順德蘭花的順利出口提供把關(guān)服務(wù)。

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