多次油苗免疫刺激禽白血病內(nèi)源性抗體的表達研究

李玉燕 鞏新民 祝永華 衣文娟 丁愛君 來慶梅 郭龍宗

摘? 要：本試驗將200只SPF雞分為免疫組和非免疫組兩組，在4周齡時混入HBD祖代雞群2個批次，100只/組。將SPF雞均勻的分布到5個雞舍，每組每舍20只。免疫組的SPF雞均按照祖代雞的免疫程序進行油苗、活苗免疫;非免疫組不進行油苗免疫，僅免疫活苗。分別在9、19、26、30、34周齡采集SPF免疫組和非免疫組的血清，檢測ALV-J、ALV-AB的抗體。SPF免疫組和非免疫組ALV抗體的差異顯著性分析結果顯示：在HBD祖代雞群ALV-AB和ALV-J亞型抗體水平正常的情況下，隨著油苗免疫次數(shù)的增加，SPF免疫組和非免疫組在26周齡時的ALV-J和ALV-AB亞型的抗體水平均差異極顯著（P<0.001），在19周齡和34周齡均有不同程度的差異?；烊氲腍BD祖代雞群的種蛋禽白血?。ˋLV）p27和病原檢測均為陰性，不存在水平傳播的情況。這說明經(jīng)多次油苗免疫刺激后，雞只攜帶的內(nèi)源性ALV誘導產(chǎn)生的抗體能被ALV-AB 和ALV-J亞型檢測試劑盒所檢測到。

關鍵詞：油苗免疫;ALV;抗體表達

中圖分類號：S858.312.4? ? ?文獻標識碼：B? ? ?文章編號：1673-1085（2019）2-0027-04

禽白血病病毒（Avian leukosis viruses，ALV）屬于反轉錄病毒科、正反轉錄病毒亞科、α反轉錄病毒屬的一類病毒。該科病毒的基因組是RNA，以具有反轉錄酶為特征。根據(jù)囊膜蛋白gp85的特異性，ALV有A、B、C、D、E、F、G、H、I和J十個亞群，這是依照其發(fā)現(xiàn)和鑒定的年代先后確定的。其中最重要的是從雞群分離到的A～E五個亞群和J亞群。其他幾個亞群則是從其它鳥類發(fā)現(xiàn)[1]。雞的ALV分為外源性ALV和內(nèi)源性ALV兩大類。雞的外源性ALV是指不會通過宿主細胞染色體傳遞的ALV，包括A、B、C、D和J亞群，致病性強的雞ALV都屬于外源性病毒。內(nèi)源性ALV是指前病毒cDNA可整合進宿主細胞染色體基因組，因而可通過染色體垂直傳播的ALV[2]。目前發(fā)現(xiàn)的能產(chǎn)生傳染性病毒的內(nèi)源性ALV都屬于E亞群。E亞群內(nèi)源性ALV雖沒有致病性，但它可干擾對外源性感染的檢測[3]，給診斷和凈化ALV帶來了很大的困難。

在“國家白血病凈化示范場”創(chuàng)建的認定標準中，白血病抗體曾是主要的指標，要求ALV-AB 和ALV-J亞型抗體為陰性，但在實際雞群飼養(yǎng)中，總是會發(fā)現(xiàn)存在病原分離檢測陰性但能檢測到抗體的情況。其中徐海鵬、孟凡峰等[3]發(fā)表的文章中闡述，某進口祖代雞場在開產(chǎn)后做常規(guī)抽樣檢測時發(fā)現(xiàn)，在一批種雞中有一定比例的血清樣品呈現(xiàn)ALV-A/B亞群抗體陽性，而且種蛋蛋清的ALV-p27抗原檢測中也有一定比例陽性。然而，整個雞群無任何發(fā)病表現(xiàn)，產(chǎn)蛋率等也很正常。并且按照常規(guī)方法接種DF1細胞和SPF雞胚來源的雞胚成纖維細胞（CEF）也未分離到任何病毒。通過對23只種雞所產(chǎn)種蛋孵化后制備的CEF盲傳3代后檢測到1株E亞群ALV，并證明其誘導產(chǎn)生的抗體能夠干擾對外源性ALV的鑒別診斷。該研究還提出另一問題，為什么這批種雞會在開產(chǎn)前后有顯著比例的個體表達和產(chǎn)生ALV-E，并誘發(fā)抗體產(chǎn)生。本研究對這一問題進行了回答，證實在種雞群開產(chǎn)前經(jīng)多次油苗免疫刺激下，某些內(nèi)源性ALV誘導產(chǎn)生的抗體能被ALV-AB和ALV-J亞型檢測試劑盒所檢測到。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 試驗動物? 200只4周齡SPF雞購自山東益吉達生物科技有限公司。試驗種雞群選用同周齡HBD祖代種雞群（批次：20161009，20161016），來自山東益生種畜禽股份有限公司。

1.1.2? 樣品的采集與處理? SPF雞油苗免疫組和非免疫組分別于9、19、26、30、34周齡同時采集雞只的血清。用2.5ml注射器從翅靜脈采集2ml血液，將注射器置于高于25℃的地方，靜置析出血清。

1.1.3? 試劑? 禽白血病病毒J亞群抗體ELISA檢測試劑盒、禽白血病病毒AB亞群抗體ELISA檢測試劑盒、禽白血病抗原ELISA檢測試劑盒均為美國IDEXX公司產(chǎn)品，批號為：ALV-J：JM660，有效期至2017/11/30;ALV-AB：HM591，有效期至2017/11/18;ALV-Ag（p27）：GM474，有效期至2018/1/7。

1.2? 方法? 200只SPF雞分為免疫組和非免疫組，每組各100只。在4周齡時將SPF雞混入HBD祖代種雞群2個批次，平均分到5個雞舍，每舍每組各20只。SPF雞群免疫組的活苗、油苗免疫按照HBD祖代種雞群免疫程序進行;非免疫組不免疫油苗，只免疫活苗，活苗全部為進口疫苗，主要是MSD（原英特威）產(chǎn)品。免疫油苗統(tǒng)計：4～9周齡累計免疫油苗4次，4～19周齡累計免疫油苗12次，4～26周齡累計免疫油苗14次，4～34周齡累計免疫油苗14次。分別于9、19、26、30、34周齡采集SPF免疫組和非免疫組的血清，檢測ALV-J、ALV-AB抗體。分別于25、26、27、28、36周齡對混入的20161009和20161016批的HBD祖代種雞群采集血清，檢測ALV-J、ALV-AB抗體。在26～28周齡，對開產(chǎn)后20161009和20161016批HBD祖代種雞群采集190枚種蛋，進行種蛋ALV的p27抗原檢測。

2? 結果

對SPF油苗免疫組與非免疫組ALV-J、ALV-B的抗體水平，雞混入HBD祖代雞群后，4～9周齡，SPF雞免疫組雞群共免疫4次油苗，9周齡采集血清檢測AB亞群和J亞群ALV抗體，結果顯示：SPF雞免疫組和非免疫組的ALV-AB和ALV-J的抗體水平差異均不顯著（P>0.05）;4～19周齡，SPF雞免疫組雞群免疫12次油苗，19周齡采集血清的ALV抗體結果顯示：SPF雞免疫組和非免疫組的ALV-AB的抗體水平差異顯著（P<0.05），ALV-J的抗體水平差異極顯著（P<0.001）;4～26周，SPF雞免疫組雞群免疫14次油苗，26周齡采集血清的ALV抗體結果顯示：SPF雞免疫組和非免疫組的ALV-AB和ALV-J的抗體水平均差異極顯著（P<0.001）;4～30，SPF雞免疫組雞群免疫14次油苗，30周采集血清的ALV抗體結果顯示：SPF雞免疫組和非免疫組的ALV-AB和ALV-J的抗體水平均差異不顯著（P>0.05）;4～34周齡時，SPF雞免疫組雞群免疫14次油苗，34周齡采集血清的ALV抗體結果顯示：SPF雞免疫組和非免疫組的ALV-AB和ALV-J的抗體水平均差異顯著（P<0.05），結果見表1、表2。各周齡SPF雞免疫組ALV-AB和ALV-J的抗體陽性率均顯著高于非免疫組，結果見圖1、圖2。

2.2? HBD祖代雞群的ALV-AB、ALV-J的抗體水平? SPF雞混入的20161009/1016批HBD祖代雞群，各周齡采集血清的ALV-AB和ALV-J的抗體水平均正常（見表3）。

在26～28周齡，對開產(chǎn)后20161009和20161016批HBD祖代種雞群采集190枚種蛋，進行ALV的p27抗原檢測，檢測結果均為陰性。

3? 討論

徐海鵬、孟凡峰等[3]研究發(fā)現(xiàn)，某些遺傳背景的品系雞，其基因組中的內(nèi)源性ALV-E在某種條件誘發(fā)下表達量可能會異常提高，也可能干擾對ALV抗體的檢測。因此，在一些認為是ALV凈化的雞群，當血清ALV-AB或ALV-J的抗體陽性率顯著高于標準時，要結合雞群臨床表現(xiàn)并取血漿或蛋清樣品接種DF1細胞進行病毒分離鑒定來做最終判斷。目前不建議在禽白血病凈化程序中把抗體檢測作為一項指標[4]。

雞細胞基因組某個特定位點含有（穩(wěn)定地整合）能復制可傳染性病毒粒子的E亞群ALV的全基因組，如性染色體Z上的ev21位點，該位點與決定快慢羽相關基因K緊密連鎖，ev21可產(chǎn)生傳染性病毒EV21。在雞的基因組上帶有ev21等完整的或不完整的ALV-E基因組片段，并不代表就一定會表達，這決定于每一個雞個體的多種遺傳生理因素，甚至同一個體不同生理條件下也不一樣。例如，海蘭褐祖代的AB系、父母代的公雞、商品代母雞中的1/2個體都帶有ev21，但一般都不表達p27，或至少表達的量低到檢測不出的水平[2]。本實驗結果驗證，密集的油苗免疫可能會增加白血病內(nèi)源性因素的表達，而產(chǎn)生非感染性抗體。

隨著油苗免疫次數(shù)的增加，混入祖代雞群的SPF雞群免疫組和非免疫組ALV-AB和ALV-J抗體水平差異顯著性分析結果顯示：免疫組與非免疫組在26周齡時，SPF雞免疫組和非免疫組的ALV-AB和ALV-J的抗體水平均差異極顯著（P<0.001），在19周齡和34周齡均有不同程度的差異。SPF混入的HBD祖代雞群2個批次在各周齡采集血清的ALV-AB和ALV-J的抗體水平以及種蛋的p27抗體檢測均正常。這說明多次油苗免疫，可刺激某些雞群的ALV內(nèi)源性基因的表達，其誘導產(chǎn)生的抗體能被ALV-AB和ALV-J檢測試劑盒所檢測到。

參考文獻：

[1]? 崔治中.禽白血病及其防控百問百答（一）[J]. 中國家禽，2016，38（23）：72-76.

[2]? 崔治中.中國雞群病毒性腫瘤病及防控研究[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2013：2-3.

[3]? 徐海鵬，孟凡峰，崔治中.種蛋中內(nèi)源性禽白血病病毒的檢測和鑒定[J].畜牧獸醫(yī)學報，2014，45（8）：1317-1323.

[4]? 崔治中.禽白血病及其防控百問百答（五）[J]. 中國家禽，2017，39（3）：73-76.