高效液相色譜法測定雞血漿中恩諾沙星和環(huán)丙沙星含量

鄭育基等

摘? 要：為了研究雛雞血漿中恩諾沙星和環(huán)丙沙星含量及代謝規(guī)律，建立了本HPLC方法。血漿樣品中的藥物采用乙腈提取和凈化，熒光檢測器檢測，激發(fā)波長278nm，發(fā)射波長450nm;流動相為0.05mol/L磷酸/三乙胺-乙腈（82：18，V/V）溶液。結(jié)果表明，血漿中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的含量在0.05～10mg/L濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.999。在低、中、高三個添加濃度（0.05、0.5、10mg/L）下平均回收率在87.26%～106.36%之間，日內(nèi)變異系數(shù)低于8.97%，日間變異系數(shù)低于7.92%，檢測限和定量限分別為0.01mg/L和0.05mg/L。本方法建立的血漿提取凈化和檢測條件可用于準(zhǔn)確測定雞血漿中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的含量。

關(guān)鍵詞：HPLC;恩諾沙星;方法學(xué);雛雞

氟喹諾酮藥物因其抗菌譜廣、殺菌作用強(qiáng)、吸收快、體內(nèi)分布廣與其他抗菌藥物無交叉耐藥性等特點，廣泛用于人醫(yī)臨床與養(yǎng)殖業(yè)中[1]。生產(chǎn)上雞白痢、雞傷寒、雞副傷寒和雞支原體等病原體可通過種蛋感染雛雞。目前唯一批準(zhǔn)在雛雞上使用的抗生素是頭孢噻呋注射液，恩諾沙星是動物專用抗生素，對上述細(xì)菌感染有很好療效[2]，同時部分藥物在雞體內(nèi)代謝為環(huán)丙沙星[3]。目前恩諾沙星的檢測方法有微生物法[4]、高效液相色譜法[5]和超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法等[6]。本文在前人報道的基礎(chǔ)上[7～9]，通過色譜條件和血漿樣品處理的優(yōu)化，建立了雛雞血漿中恩諾沙星和環(huán)丙沙星含量的HPLC方法，為進(jìn)一步研究恩諾沙星注射液在雛雞體內(nèi)藥動學(xué)特征和臨床合理利用提供依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 儀器和試劑? Waters 2695高效液相色譜儀（Waters 2695，配Waters2475熒光檢測器），購自美國Waters公司;純水儀（UPH-11-20T），購自四川優(yōu)普超純科技有限公司;KQ-250B型超生波清洗器（KQ-250B型），購自昆山市超聲儀器有限公司;氮吹儀（N-EVAP），購自美國Organomation公司;漩渦混合器（WH-3），購自上海滬西分析儀器廠有限公司;電子分析天平（BS124S），購自德國賽多利斯天平公司;高速冷凍離心機(jī)（5810R）、移液槍，購自德國Eppendorf公司。

恩諾沙星與環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品（PHLC≥99.5%），批號分別為H0081505、H0101310，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;乙腈、甲醇均為色譜純，美國天地有限公司生產(chǎn);85%濃磷酸，德國CNW公司生產(chǎn);氫氧化鈉、三乙胺為分析純，國藥集團(tuán)生產(chǎn);水為超純水。

1.2? 溶液配制? 精密稱取恩諾沙星、環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品各10.05mg，分別置于10ml棕色容量瓶中，用0.03mol/L氫氧化鈉溶液溶解。

1.2.1? 標(biāo)準(zhǔn)溶液母液配制? 甲醇定容濃度為1mg/ml的儲備液，放置于4℃下保存?zhèn)溆?，有效?個月。

1.2.2? 0.05mol/L磷酸/三乙胺溶液配制? 取濃磷酸3.4ml，用水稀釋至1L，用三乙胺調(diào)pH值至3.0，備用。

1.2.3? 流動相的配制? 準(zhǔn)確吸取18ml乙腈和82ml 0.05mol/L磷酸/三乙胺溶液，渦旋混勻，備用。

1.2.4? 標(biāo)準(zhǔn)溶液工作液的配制? 準(zhǔn)確量取適量環(huán)丙沙星、恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用流動相稀釋成適宜的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，置2～8℃冰箱中保存。

1.3? 血漿樣品處理? 準(zhǔn)確吸取0.2ml新鮮或凍融的血漿樣品于1.5ml刻度離心管中渦旋1min混勻后靜置10min，加入1ml乙腈，渦旋振蕩3min，12000r/min離心10min。上清液移至10ml刻度離心管中，45℃氮?dú)獯蹈扇軇┝鲃酉鄰?fù)溶，渦旋振蕩1min，2000r/min離心1min，上清液經(jīng)0.22μm濾膜過濾，取濾液，即得。

1.4? 色譜條件? 色譜柱：Agilent HP-C18（4.6×250mm，5μm）;流速：0.8ml/min;柱溫：35℃;進(jìn)樣量：10μl;流動相：0.05mol/l磷酸/三乙胺（pH=3.0），乙腈（82：18，V/V）;熒光檢測器：激發(fā)波長278nm，發(fā)射波長450nm。

1.5? 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制? 準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別制得0.05、0.5、1、4、6和10mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列添加濃度。乙腈提取，氮?dú)獯蹈闪鲃酉鄰?fù)溶，過0.22μm濾膜上機(jī)檢測。

1.6? 檢測限和定量限? 制備5個平行空白血漿，按照1.3項下的血漿樣品處理方法處理后，上機(jī)測得平均基線噪音值。準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，制得0.005、0.01、0.05和0.1mg/L添加濃度，按1.4色譜條件進(jìn)樣分析。取信噪比S/N≥3時樣品的最低濃度為檢測限（LOD），以信噪比S/N≥10時樣品的最低濃度為最低定量限（LOQ）。

1.7? 回收率和精密度的測定? 準(zhǔn)確取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，制得0.05、0.5、10mg/L三個濃度的添加樣品，按1.3項下血漿樣品預(yù)處理方法處理后供HPLC分析，確定其峰面積與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品直接進(jìn)樣的峰面積進(jìn)行比較，計算回收率。

準(zhǔn)確取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別制得0.05、0.5、10mg/L三個濃度的空白血漿添加樣品，混勻后按“1.3”項下血漿樣品預(yù)處理方法處理后，按1.4色譜條件進(jìn)樣分析，確定其峰面積。每個濃度水平設(shè)5個平行（日內(nèi)），共重復(fù)考察3批（日間），計算出日內(nèi)和日間變異系數(shù)。

1.8? 干擾性試驗? 照上述血漿處理辦法及色譜條件，分別取空白血漿、混合標(biāo)準(zhǔn)樣品、空白加標(biāo)樣品、實測樣品各10μl進(jìn)行測定。

1.9? 實際樣品檢測? 10只體重約50g雛雞頸部皮下注射恩諾沙星2mg/只，24h心臟采血1.5ml分裝于抗凝管中，3000r/min離心10min分離出血漿，于-20℃凍存，待測。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系考察? 以色譜峰面積（S）為橫坐標(biāo)，以藥物濃度（C）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，分別得到恩諾沙星與環(huán)丙沙星線性回歸方程分別為：y=192513270.7x-112679.8;y=89631925.1x+36913113.7。結(jié)果表明，兩者在0.05～10mg/L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，見表1。

2.2? 檢測限與定量限? 在本試驗建立的色譜條件下，血漿樣品中的恩諾沙星和環(huán)丙沙星的檢測限、定量限分別為0.01mg/L和0.05mg/L。

2.3? 回收率和精密度? 回收率和精密度測定結(jié)果見表2。結(jié)果環(huán)丙沙星與恩諾沙星低、中和高三個空白血漿添加濃度（0.05、0.5、10mg/L）下的平均回收率在87.26%～106.36%之間，日內(nèi)變異系數(shù)低于8.97%，日間變異系數(shù)低于7.92%，符合《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則》要求。

2.4? 干擾性試驗? 在1.4色譜條件下，恩諾沙星、環(huán)丙沙星藥峰峰型良好與血漿中其他組分無干擾。環(huán)丙沙星和恩諾沙星的出峰時間分別為7.1min和9.0min左右?？瞻籽獫{、混合標(biāo)準(zhǔn)樣品、空白血漿加標(biāo)和實測樣品色譜圖見圖1～4。

2.5? 實際樣品檢測結(jié)果? 取5份恩諾沙星注射液皮下給藥24h后血漿，采用本方法進(jìn)行檢測，測得的恩諾沙星平均濃度為0.96mg/L，環(huán)丙沙星未檢出;按農(nóng)業(yè)部1025號公告-14-2008《動物性食品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測高效液相色譜法》的色譜條件，血漿采用本文處理辦法，測得恩諾沙星平均濃度為0.91mg/L，環(huán)丙沙星未檢出。

3? 討論與結(jié)論

3.1? 提取條件的優(yōu)化? 目前有關(guān)于氟喹諾酮類抗生素血漿中的提取主要通過甲醇[10]、乙腈[11]和乙酸乙酯等有機(jī)溶劑。本試驗分別以1ml甲醇和乙腈對標(biāo)準(zhǔn)添加樣品進(jìn)行提取，結(jié)果顯示采用甲醇和乙腈提取的回收率均達(dá)到85%以上無明顯差異。鑒于在45℃氮吹條件下乙腈揮發(fā)速度較快，可縮短樣品的處理時間，同時經(jīng)離心后萃取液澄清透明，提高了樣品的處理質(zhì)量，故選用乙腈為提取劑。

3.2? 色譜條件的優(yōu)化? 文獻(xiàn)報道流動相主要采用甲醇-四丁基溴化胺[12]、乙睛-四丁基溴化胺[13]、乙睛-甲醇-磷酸鹽[14]等。國標(biāo)中以乙睛-磷酸溶液為流動相，采用熒光檢測器檢測，激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為280nm和450nm[17]。通過全波長掃描在278nm處有最大吸收峰，流動相用三乙胺調(diào)pH值到3時，既可以有效將藥物與基質(zhì)分離，同時能避免峰拖尾現(xiàn)象。通過對柱溫的篩選發(fā)現(xiàn)，在25～35℃范圍內(nèi)，柱溫升高出峰時間略微提前，故確定柱溫為35℃。對流動相中乙睛比例優(yōu)化試驗顯示，乙睛比例過小洗脫不徹底雜質(zhì)峰出現(xiàn)，乙睛比例加大則出峰時間前移檢測時間縮短。在相同條件下，磷酸/三乙胺-乙腈比例為82：18（V/V）時分離效果最好。

在本試驗所建立的HPLC條件下，血漿中恩諾沙星及其代謝物環(huán)丙沙星含量測定的方法靈敏度、準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性均滿足檢測要求，適用于雞血漿中恩諾沙星和環(huán)丙沙星含量的測定。

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