鐘文德 嘉紅云 陳廣盛
廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院(廣州510260)
口腔癌是頭頸腫瘤的主要類型,其中大部分為口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)[1]。盡管近年對(duì)OSCC的早期診斷和治療有明顯提高,但患者5年生存率仍不足50%[2]。腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)的存在是腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)鍵,而上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchyrnal transition,EMT)的發(fā)生是癌細(xì)胞獲得干細(xì)胞樣表型的重要途徑,miRNAs 與癌細(xì)胞干性的獲得密切相關(guān)[3]。FAN等[4]指出過(guò)表達(dá)miR-26b可促進(jìn)結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系的EMT和干細(xì)胞樣表型獲得而增加腫瘤致病性,有趣的是FUKUMOTO[5]研究卻發(fā)現(xiàn)miR-26b 對(duì)OSCC 具有抑癌作用。但miR-26b 對(duì)口腔癌細(xì)胞腫瘤干性的影響到底如何尚無(wú)報(bào)道。本研究希望通過(guò)探討miR-26b 對(duì)人口腔鱗癌細(xì)胞SCC15 干性的影響,為上述問(wèn)題提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),同時(shí)為OSCC 治療靶點(diǎn)的尋找提供新思路。
1.1 主要試劑胎牛血清和DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司,miRNA 分離試劑購(gòu)自美國(guó)Ambion公司,miRNA-26b 特異性引物和探針、TaqMan miRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和TaqMan miRNA 檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems 公司。TRIzol 溶液、Lipofectamine 2000 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司。miR-26b 模擬物、miR-26b 抑制物、陰性對(duì)照、miR-26b 特異性PCR 引物購(gòu)自廣州銳博生物。β-actin 及E-鈣粘蛋白抗體購(gòu)自Cell Signal 公司。
1.2 研究對(duì)象5例口腔鱗癌患者均來(lái)自2015年至2017年到我院就診病人,男4例,女1例,年齡48~72歲。納入標(biāo)準(zhǔn):患者病灶位置的病理標(biāo)本均已確診。其中伴淋巴轉(zhuǎn)移者2例,未轉(zhuǎn)移者3例;病灶位置分類:舌癌4例,牙齦癌1例;WHO 病理分級(jí):高分化4例,低分化1例;取患者各自癌旁正常口腔組織作為對(duì)照組。人口腔鱗狀癌細(xì)胞SCC15 常規(guī)復(fù)蘇,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染接種SCC15 細(xì)胞于6 孔板中;以Lipofectamine 2000 為轉(zhuǎn)染試劑分別用陰性對(duì)照、miR-26b 模擬物和miR-26b 抑制物對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,并據(jù)此把細(xì)胞分為NC 組、過(guò)表達(dá)組、抑制組。8 h 后培養(yǎng)液更換為含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h 行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
1.4 RNA 提取和real-time PCR按試劑盒操作說(shuō)明提取SCC15 細(xì)胞、目標(biāo)患者口腔癌組織及癌旁正常組織的總RNA,Real-time PCR 檢測(cè)樣本miR-26b 表達(dá)水平。癌組織miR-26b 表達(dá)以癌旁正常組織miR-26b 為對(duì)照,結(jié)果用2-(Ct 肝癌細(xì)胞—Ct 癌旁正常組織)方式表示。SCC15 細(xì)胞以U6為內(nèi)參,結(jié)果用2-[過(guò)表達(dá)組/抑制組Ct(miR-26b-U6)- 對(duì)照組Ct(miR-26b-U6)]表示以觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果;繼而以GAPDH 為內(nèi)參,檢測(cè)Nanog 及OCT4(表1)的表達(dá),結(jié)果以2-△△Ct表示。
表1 Real-time PCR 檢測(cè)引物Tab.1 Real-time PCR detection primers
1.5 體外成球?qū)嶒?yàn)無(wú)血清培養(yǎng)基內(nèi)添加2%B27、20 ng/mL 表皮生長(zhǎng)因子、20 ng/mL 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、1%的甲基纖維素,調(diào)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)液pH約6.8左右。以約2 000個(gè)/孔接種SCC15細(xì)胞于6孔板,7 d后計(jì)算細(xì)胞球形成效率(直徑>75 μm的細(xì)胞球個(gè)數(shù)/2 000)。
1.6 免疫印跡法以β-actin 為內(nèi)參,檢測(cè)E-鈣粘蛋白水平,ImageJ 1.35V 軟件進(jìn)行分析,結(jié)果以E-鈣粘蛋白密度/β-actin 密度表示。
1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法SPSS 16.0 行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較用雙側(cè)t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 miR-26b 表達(dá)在口腔癌組織中下調(diào)見(jiàn)圖1。5例口腔癌患者癌組織中miR-26b的表達(dá)量均<1,表明患者口腔癌組織miR-26b 表達(dá)均低于癌旁正常組織。
2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果過(guò)表達(dá)組SCC15 細(xì)胞的miR-26b 表達(dá)量為(22.22±2.70),顯著高于NC 組(P<0.05),抑制組的表達(dá)量為(0.34±0.07),顯著低于NC 組(P<0.05)。結(jié)果顯示本次細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果良好。
2.3 miR-26b 對(duì)SCC15 細(xì)胞體外成球能力的影響體外成球?qū)嶒?yàn)100 倍鏡下觀察結(jié)果見(jiàn)圖2,過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞成球率明顯低于NC 組(P<0.05),抑制組的成球率則高于NC 組(P<0.05)。
圖1 miR-26b 在口腔癌患者癌組織中的表達(dá)Fig.1 The expression of miR-26b in oral cancer patients′cancerous tissue
2.4 miR-26b 對(duì)SCC15 細(xì)胞干性基因表達(dá)的影響見(jiàn)圖3。過(guò)表達(dá)組Nanog 及OCT4 基因表達(dá)量明顯低于NC 組(P<0.05),抑制組2個(gè)干性基因表達(dá)量則高于NC 組(P<0.05)。
2.5 miR-26b 對(duì)SCC15 細(xì)胞E-鈣粘蛋白水平的影響見(jiàn)圖4。抑制組SCC15 細(xì)胞E-鈣粘蛋白水平低于NC 組(P<0.05),過(guò)表達(dá)組E-鈣粘蛋白水平高于NC 組(P<0.05)。
圖2 miR-26b 對(duì)SCC15 細(xì)胞體外成球能力的影響Fig2 The effect of miR-26b on SCC15 cells in Sphere experiment
圖3 miR-26b 對(duì)SCC15 細(xì)胞干性基因表達(dá)的影響Fig3 The effects of miR-26b on stemness gene expression of SCC15 cells
圖4 miR-26b 對(duì)SCC15 細(xì)胞E-鈣粘蛋白的影響Fig4 The effect of miR-26b on E-cadherin of SCC15 cells
OSCC 占口腔腫瘤的95%及頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的40%,發(fā)展中國(guó)家OSCC 高居男性常見(jiàn)腫瘤的第六位及女性的第十位[2]。雖然目前包括手術(shù)、放療、化療等治療手段有了長(zhǎng)足發(fā)展,但其高復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率使OSCC 患者的5年存活率仍然偏低[6]。miRNAs 參與調(diào)節(jié)OSCC的發(fā)病及預(yù)后[7],F(xiàn)UKUMOTO等[5]構(gòu)建了一個(gè)針對(duì)OSCC的miRNA矩陣對(duì)差異表達(dá)的miRNAs 進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)miR-26b缺失可通過(guò)調(diào)控跨膜基因TMEM184B 而增強(qiáng)OSCC 癌細(xì)胞的致病力。BAGHAEI等[8]則通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了過(guò)表達(dá)miR-26b 能抑制口腔鱗癌細(xì)胞的遷移、侵襲及增殖。雖然有研究[4]顯示miR-26b可促進(jìn)結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移,但LI等[9]實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻顯示miR-26b 能明顯抑制同樣屬于消化道腫瘤的食道癌細(xì)胞的增值,提示miR-26b 可能是一個(gè)多能基因,在各種腫瘤中表現(xiàn)出不同功能。而對(duì)于OSCC,本研究發(fā)現(xiàn)5例口腔癌患者的癌組織中miR-26b的表達(dá)顯著低于相鄰的正常組織,結(jié)合FUKUMOTO等[5]和BAGHAEI等[8]的研究,miR-26b 對(duì)OSCC 是一個(gè)抑癌基因。
CSCs 是腫瘤組織或者轉(zhuǎn)移灶中存在的一群具有自我更新能力的細(xì)胞,具有成體干細(xì)胞的功能特征,這種能力被稱之為腫瘤細(xì)胞的“干性”,與腫瘤的復(fù)發(fā)密切正相關(guān)性,也是OSCC 惡化的主要驅(qū)動(dòng)力之一[10]。miRNAs 可調(diào)控腫瘤干性的獲得[11],TROMPETER等[12]發(fā)現(xiàn)miR-26b 能加速臍帶血成體干細(xì)胞的分化,LIN等[13]也發(fā)現(xiàn)miR-26b 可下調(diào)上皮卵巢癌細(xì)胞干性基因OCT4 表達(dá)并抑制其遷移,顯示miR-26b 對(duì)部分癌細(xì)胞的干性具有抑制作用,但目前未見(jiàn)miR-26b 影響OSCC 干性的報(bào)道,因此本研究以經(jīng)典的OSCC 細(xì)胞模型SCC15 為對(duì)象,進(jìn)行了初步的探討。成球能力是單個(gè)癌細(xì)胞自我更新能力的重要表現(xiàn),Sphere 實(shí)驗(yàn)是通過(guò)觀察癌細(xì)胞的成球能力從而評(píng)估腫瘤細(xì)胞干性的重要體外實(shí)驗(yàn)方法[14],Nanog和OCT4 作為維持干細(xì)胞自我更新和多能性的關(guān)鍵因子,能使終端分化細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期而進(jìn)行增殖活動(dòng),是腫瘤細(xì)胞干性獲得的重要分子標(biāo)志物[15]。本次實(shí)驗(yàn)顯示SCC15 細(xì)胞在過(guò)表達(dá)miR-26b 后成球能力下降,抑制miR-26b 后成球能力增加;同時(shí)miR-26b 能抑制SCC15 細(xì)胞Nanog和OCT4 兩個(gè)干性基因的表達(dá),表明miR-26b 對(duì)SCC15 細(xì)胞的腫瘤干性有負(fù)調(diào)節(jié)作用,與本研究的預(yù)期相符。
EMT 能上調(diào)血管生成前因子VEGF-A的表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤血管生成的增加,從而增加腫瘤細(xì)胞移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)時(shí)啟動(dòng)和增殖腫瘤的能力,這是CSCs 豐富的一個(gè)主要特征,提示EMT的發(fā)生與腫瘤細(xì)胞干性獲得密切相關(guān)[16]。E-鈣粘蛋白主要分布在上皮細(xì)胞,具有抑制轉(zhuǎn)移的作用,OSCC 中E-鈣粘蛋白表達(dá)的下降是其EMT 過(guò)度發(fā)生的重要標(biāo)志[17]且與其疾病預(yù)后相關(guān)[18]。本次Western Blot 結(jié)果顯示miR-26b 能正向調(diào)節(jié)SCC15細(xì)胞的E-鈣粘蛋白表達(dá),因此筆者推測(cè)miR-26b可能通過(guò)提高OSCC 細(xì)胞E-鈣粘蛋白水平而抑制其EMT的發(fā)生,從而延緩口腔癌細(xì)胞對(duì)腫瘤干性的獲得。本研究結(jié)論僅在體外針對(duì)一種OSCC 細(xì)胞得到體現(xiàn),下一步將以修飾miR-26b 表達(dá)的OSCC 細(xì)胞對(duì)裸鼠行定植實(shí)驗(yàn),希望通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證,繼續(xù)完善本研究結(jié)論。
綜上所述,本研究提示miR-26b 具有抑制口腔癌細(xì)胞SCC15 腫瘤干性的作用,為miR-26b 對(duì)OSCC的抑制作用提供了一定的理?yè)?jù),miR-26b 具有成為OSCC 治療靶點(diǎn)的潛力,為OSCC的根治提供了新的思考方向。