肖維威,張 寶,趙 衛(wèi),朱 利,吳清華

(南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,中國廣東廣州510515)

隨著基因工程為代表的生物技術(shù)的迅猛發(fā)展,轉(zhuǎn)基因作物自1996年種植商業(yè)化以來,其種植規(guī)模越來越大。據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織(ISAAA)統(tǒng)計,全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積從1996年的170萬公頃增加到2017年的1.898億公頃,足足增長了112倍[1]。

轉(zhuǎn)基因作物種植面積增長越多,呈現(xiàn)在公眾視野的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品也就越多。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品在中長期可能存在潛在的健康和環(huán)境風(fēng)險[2],這給轉(zhuǎn)基因作物以及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全管理帶來了巨大的挑戰(zhàn)。為保障消費者的知情權(quán)和選擇權(quán),我國《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識管理辦法》和《轉(zhuǎn)基因食品衛(wèi)生管理辦法》規(guī)定對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品必須進(jìn)行標(biāo)識。而對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行定性定量檢測是轉(zhuǎn)基因生物安全管理和標(biāo)識的重要一環(huán)。目前轉(zhuǎn)基因成分的檢測分析分為基于外源基因的檢測技術(shù)和基于外源基因表達(dá)蛋白的檢測技術(shù)兩大類[2]。因為核酸的穩(wěn)定性和普遍性,所以基于外源基因的檢測技術(shù)應(yīng)用更為廣泛[3]。外源基因檢測的靶標(biāo)包括啟動子、報告基因、目的基因和終止子,其中啟動子和終止子是表達(dá)外源目的基因所必需的調(diào)控元件。CaMV35S啟動子、NOS終止子是轉(zhuǎn)基因作物中使用時間最早、使用頻率最高的啟動子和終止子[4～6]。因此,針對 CaMV35S 啟動子、NOS終止子的檢測可用于待檢樣品中轉(zhuǎn)基因成分的初步篩查和檢測。

實際檢測工作中,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(陽性對照)的缺乏,已嚴(yán)重影響到轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化、轉(zhuǎn)基因生物安全管理以及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識制度的執(zhí)行[7]。本文采用有別于傳統(tǒng)酶切連接方式的重疊延伸PCR技術(shù)[8],設(shè)計帶有互補接頭的特異性引物,快速構(gòu)建包含CaMV35S啟動子、NOS終止子和植物通用內(nèi)源基因RBCL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子,以期作為一種新型的陽性對照廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物成分的篩查檢測。

1 材料和方法

1.1 材料

轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2、轉(zhuǎn)基因玉米Bt11標(biāo)準(zhǔn)品購自歐洲IRMM (Institute of Reference Materials and Measurement)。

1.2 主要試劑

Premix Taq DNA聚合酶、Premix Ex Taq DNA聚合酶、pMD18-T載體、DNA分子量marker等購自寶生物工程(大連)有限公司;凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自O(shè)MEGA公司(美國);DH5α菌株為本實驗室保存;引物及探針由上海Invitrogen生物公司合成,序列見表1。

表1 重疊延伸PCR引物Table 1 Primers used for overlap extension PCR

1.3 基因組總DNA的提取

參照國家標(biāo)準(zhǔn)CTAB-2法[9],提取轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2和轉(zhuǎn)基因玉米Bt11的基因組DNA。

1.4 重疊延伸PCR重組CaMV35S啟動子、NOS終止子和RBCL基因

將提取的轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2基因組DNA用表1中的引物分別擴增內(nèi)源基因RBCL、Ca-MV35S啟動子和NOS終止子。反應(yīng)體系:DNA 模板 1.0 μL(50 ng),2× Premix Taq 12.5 μL,10.0 μmol/L 上、下游引物各 1.0 μL,補水至 25.0 μL。反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,循環(huán)30次;72℃延伸7 min。以RBCL和CaMV35S啟動子帶接頭的PCR產(chǎn)物作為雙模板,各取0.5 μL,加2×Premix Taq 25.0 μL,補水至50.0 μL反應(yīng)體系。在94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s,72℃延伸30 s,并循環(huán)10次進(jìn)行延伸反應(yīng),得到重組片段RBCLCaMV35S(圖1)。以NOS終止子擴增產(chǎn)物和RBCL-CaMV35S片段作為雙模板,各取0.5 μL,加2×Premix Taq 25.0 μL,補水至 46.0 μL 反應(yīng)體系。在94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s,72℃延伸30 s,并循環(huán)10次進(jìn)行延伸反應(yīng),得到重組片段RBCL-CaMV35S-NOS(圖 2)。補加 RBCL-F 和 NOSR引物各2.0 μL,使反應(yīng)體系總體積達(dá)到50.0 μL,隨后PCR擴增重組片段RBCL-CaMV35S-NOS。反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,循環(huán)30次;72℃延伸7 min。

1.5 AT克隆

按照pMD18-T載體試劑盒說明書,將上述重疊延伸PCR重組片段RBCL-CaMV35S-NOS與pMD18-T載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。在含Amp+的固體培養(yǎng)基平板上過夜培養(yǎng),隨機挑取白色菌落進(jìn)行快速PCR篩查。

1.6 PCR鑒定

圖1 重疊延伸PCR重組RBCL與CaMV35S的示意圖Fig.1 Sketch map of recombination of the RBCL and CaMV35S fragments by overlap extension PCR

圖2 重疊延伸PCR重組RBCL-CaMV35S與NOS的示意圖Fig.2 Sketch map of recombination of the RBCL-CaMV35S and NOS fragments by overlap extension PCR

挑取白色菌落,接種到含Amp+的LB液體培養(yǎng)基中,250 r/min震蕩培養(yǎng)5 h后,取200 μL菌液在6 000 r/min條件下離心5 min,去上清液。在沉淀中加20 μL滅菌水重新懸浮,將其放在沸水鍋煮10 min左右后,在12 000 r/min條件下離心3 min,取含有質(zhì)粒的上清1～2 μL作為模板,用pMD18-T載體通用引物Tvector-1(5′-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3′)和 Tvector-2(5′-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3′)進(jìn)行擴增篩選。反應(yīng)體系:上清液 1.0 μL,2× Premix Ex Taq 10 μL,5.0 μmol/L的pMD18-T載體通用引物Tvector-1和Tvector-2各1.0 μL,補水至25.0 μL。反應(yīng)參數(shù):95℃預(yù)變性4 min;95℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,循環(huán)30次。

1.7 序列分析

根據(jù)PCR篩查結(jié)果繼續(xù)擴大培養(yǎng)陽性克隆菌,提取質(zhì)粒,送華大基因公司進(jìn)行測序。

1.8 替代性分析

對質(zhì)粒DNA與基因組DNA進(jìn)行可替代性研究。分別提取pMD-RBCL-CaMV35S-NOS重組質(zhì)粒DNA與轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2、轉(zhuǎn)基因玉米Bt11基因組DNA,采用表2檢測引物(不帶引物接頭)分別擴增RCBL、CaMV35S和NOS基因片段進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。反應(yīng)體系:模板DNA分子1.0 μL,2× Premix Ex Taq 12.5 μL,5.0 μmol/L 的上、下游引物各1.0 μL,補水至25.0 μL。反應(yīng)參數(shù):95℃預(yù)變性4 min;95℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,循環(huán)30次。

2 結(jié)果與分析

2.1 RBCL基因、CaMV35S啟動子和NOS終止子的擴增

用RBCL-F與RBCL-R+引物擴增轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的內(nèi)源基因RBCL,目的片段為454 bp;用35S-F+與35S-R+引物擴增CaMV35S啟動子,目的片段為236 bp;用NOS-F+與NOS-R引物擴增NOS啟動子,目的片段為200 bp。結(jié)果如圖3所示,擴增產(chǎn)物與預(yù)期目的片段大小一致。

2.2 RBCL基因、CaMV35S啟動子和NOS終止子的重疊延伸PCR重組

圖3 RBCL、CaMV35S啟動子和NOS終止子的擴增結(jié)果M:DL500 marker;1,2:RBCL擴增產(chǎn)物;3,4:CaMV35S擴增產(chǎn)物;5,6:NOS擴增產(chǎn)物。Fig.3 Analysis of the amplification fragments of RBCL,CaMV35S promoter and NOS terminator in 2%agarose gelM:DL500 marker;1,2:Amplification products of RBCL;3,4:Amplification products of CaMV35S promoter;5,6:Amplification products of NOS terminator.

RBCL擴增產(chǎn)物和CaMV35S啟動子擴增產(chǎn)物通過接頭互補,經(jīng)重疊延伸PCR重組得到RBCL-CaMV35S片段,再將RBCL-CaMV35S片段與NOS終止子擴增產(chǎn)物混合,通過35S-R+引物與NOS-F+引物的完全互補,重疊延伸PCR重組得到RBCL-CaMV35S-NOS片段,大小為849 bp。結(jié)果如圖4所示,擴增產(chǎn)物與預(yù)期片段大小一致。

圖4 RBCL、CaMV35S啟動子和NOS終止子的重疊延伸PCR重組結(jié)果1,2:RBCL-CaMV35S-NOS重組片段;M:DL2000。Fig.4 Analysis of the recombination fragments of RBCL,CaMV35S promoter and NOS terminator by overlap extention PCR in 2%agarose gel1,2:Recombination products of RBCL-CaMV35S-NOS;M:DL2000.

表2 PCR檢測引物Table 2 Primers used for PCR detection

2.3 PCR鑒定

重組片段RBCL-CaMV35S-NOS經(jīng)AT克隆后,從培養(yǎng)板隨機挑取6個菌落進(jìn)行初步篩查,以陽性克隆菌液作為模板,用pMD18-T載體通用引物 Tvector-1(5′-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3′)和 Tvector-2(5′-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3′)進(jìn)行擴增。結(jié)果如圖5所示,4號、5號克隆擴增產(chǎn)物與目的片段大小接近。

圖5 PCR鑒定陽性克隆1～6:1～6 號克隆擴增結(jié)果;M:DL2000。Fig.5 Analysis of the PCR products in 2%agarose gel1～6:Amplification products of 1～6 clones;M:DL2000.

2.4 序列分析

根據(jù)上述PCR鑒定結(jié)果,挑選其中的4號、5號陽性克隆菌提取質(zhì)粒送華大基因公司測序,測序結(jié)果如圖6所示。經(jīng)DNASTAR-MegAlign比對,與預(yù)期序列相吻合,說明包含RBCL、CaMV35S、NOS基因片段的重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將該重組質(zhì)粒命名為pMD-RBCL-CaMV35S-NOS,其物理圖譜見圖7。

2.5 替代性研究

提取pMD-RBCL-CaMV35S-NOS重組質(zhì)粒DNA與標(biāo)準(zhǔn)品轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2、轉(zhuǎn)基因玉米Bt11的基因組DNA作為模板,分別擴增RCBL、CaMV35S和NOS基因片段,結(jié)果如圖8所示:質(zhì)粒DNA與標(biāo)準(zhǔn)品基因組DNA擴增的3個片段大小一致,與預(yù)期的433 bp、195 bp和180 bp大小相符,說明可以替代為陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行檢測分析。

3 討論

目前針對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品外源基因的檢測方法主要有核酸分子雜交技術(shù)(如Southern-blot)、PCR檢測技術(shù)和基因芯片技術(shù)[10]等。為保證檢測結(jié)果的可靠性,外源基因的檢測都必須以一種準(zhǔn)確、可靠、穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為陽性對照。傳統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是以轉(zhuǎn)基因材料與其對應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因材料按一定的質(zhì)量比例配制而成[7],目前主要依靠從國外購買,不僅價格高,而且購買很不方便,嚴(yán)重影響日常轉(zhuǎn)基因檢測工作及檢測技術(shù)研究的開展,因此亟需研制新型陽性對照材料。

質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子是一種含有目的基因和內(nèi)參基因的特異性片段的重組質(zhì)粒分子。與傳統(tǒng)的陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相比,質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子具有以下幾方面的優(yōu)點:1)可以通過微生物進(jìn)行大量培養(yǎng)無限獲得,提取簡便,純度高,用量少;2)可長期保存,穩(wěn)定性好,使檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性得到很大的提高;3)同一個標(biāo)準(zhǔn)分子可設(shè)計同時重組多個外源基因,經(jīng)濟高效,是GMO(genetically modified organism)鑒定檢測中很好的陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)替代物。因此,構(gòu)建陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子已成為國際上轉(zhuǎn)基因檢測領(lǐng)域的研究熱點[11～12]。

目前國際上所構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)分子都是將1個轉(zhuǎn)基因作物品系的內(nèi)參基因和目的基因同時克隆到1個質(zhì)粒中,在做不同作物轉(zhuǎn)基因成分的檢測時,需要多個標(biāo)準(zhǔn)分子,比較繁瑣[13]。本研究將大豆、玉米、油菜和水稻等轉(zhuǎn)基因作物常用的CaMV35S啟動子、NOS終止子和植物內(nèi)參基因RBCL同時克隆到pMD18-T載體中,獲得了pMD-RBCLCaMV35S-NOS重組質(zhì)粒。RBCL基因作為轉(zhuǎn)基因作物檢測的共同內(nèi)參基因,克服了現(xiàn)行的“一種作物需要一種檢測內(nèi)對照”的弊病。據(jù)統(tǒng)計,約80%～85%的商業(yè)化轉(zhuǎn)基因作物使用了該CaMV35S啟動子,90%以上的轉(zhuǎn)基因作物使用了NOS終止子[14～15]。因此選用CaMV35S啟動子和NOS終止子作為轉(zhuǎn)基因作物成分的檢測靶標(biāo),是篩查檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品最簡單而又行之有效的方法。而且,對一些未經(jīng)授權(quán)或外源基因信息尚未公開的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品,CaMV35S啟動子或/和NOS終止子的檢測甚至是唯一可行的方法。

質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的構(gòu)建一般采用酶切方式,但有時并不一定能夠找到合適的酶切位點。本研究采用重疊延伸PCR技術(shù),不需要限制性內(nèi)切酶,通過設(shè)計部分互補(接頭互補)或完全互補的特異性引物,將RCBL、CaMV35S啟動子和NOS終止子的基因片段通過PCR擴增、重疊延伸分步連接起來,再將連接片段克隆至pMD18-T載體,獲得重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-RBCL-CaMV35S-NOS。重疊延伸PCR技術(shù)除可應(yīng)用于不同DNA片段的重組構(gòu)建之外,還可以應(yīng)用于突變基因的構(gòu)建[16～17]、長片段基因的合成[18～19]、多基因序列的拼接[20～21]等研究。

圖6 重組質(zhì)粒序列分析結(jié)果Fig.6 Sequences of the integrated DNAs in the recombination plasmid

圖7 pMD-RBCL-CaMV35S-NOS重組質(zhì)粒示意圖Fig.7 Schematic illustration of the recombinant plasmid pMD-RBCL-CaMV35S-NOS

圖8 PCR檢測結(jié)果M:DL500;1:質(zhì)粒RBCL擴增產(chǎn)物;2:GTS40-3-2 RBCL擴增產(chǎn)物;3:Bt11 RBCL擴增產(chǎn)物;4:質(zhì)粒CaMV35S擴增產(chǎn)物;5:GTS40-3-2 CaMV35S擴增產(chǎn)物;6:Bt11 CaMV35S擴增產(chǎn)物;7:質(zhì)粒NOS擴增產(chǎn)物;8:GTS40-3-2 NOS擴增產(chǎn)物;9:Bt11 NOS擴增產(chǎn)物。Fig.8 Analysis of the PCR products in 2%agarose gelM:DL500;1:RBCL amplification products from plasmid;2:RBCL amplification products from GTS40-3-2 genome;3:RBCL amplification products from Bt11 genome;4:CaMV35S amplification products from plasmid;5:CaMV35S amplification products from GTS40-3-2 genome;6:CaMV35S amplification products from Bt11 genome;7:NOS amplification products from plasmid;8:NOS amplification products from GTS40-3-2 genome;9:NOS amplification products from Bt11 genome.

本研究通過重疊延伸PCR技術(shù)成功構(gòu)建了pMD-RBCL-CaMV35S-NOS質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子,通過針對CaMV35S啟動子和NOS終止子的檢測分析證實,該質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子可替代陽性標(biāo)準(zhǔn)品廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物成分的初步篩查檢測。