馬曉，陳剛，梁盼

（1.河南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.鄭州師范學(xué)院，河南 鄭州 450044）

‘鳳丹’牡丹為芍藥屬落葉亞灌木，是中國栽培牡丹品種的近緣野生種之一[1]?！P丹’牡丹又稱為銅陵牡丹、銅陵鳳丹，屬于江南品種群，其根皮具有解熱、陣痛和消炎等醫(yī)用作用，是一種名貴藥材，《中藥大辭典》明文記載：“安徽省銅陵鳳凰山所產(chǎn)丹皮質(zhì)量最佳”，所以被稱為鳳丹[2]。近期研究表明，鳳丹牡丹種子出油率為27%～33%，籽油含大量不飽和脂肪酸（＞90%），特別是α-亞麻酸含量達(dá)39%以上。由于α-亞麻酸對于保護(hù)心血管、抑制癌癥發(fā)生等具有顯著的生理活性，具有較高的醫(yī)療保健價值[3]。因此，‘鳳丹’不僅有一定的觀賞價值，還可以體現(xiàn)其藥用價值和油用價值[4]。

多糖是一種能維持人體生命活動正常運轉(zhuǎn)的重要生物大分子[5]。植物多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老、降血糖等多種生物活性、毒副作用小和不易造成殘留等優(yōu)點[6-7]。常用的提取方法有：熱水浸提法、酸浸提法、堿浸提法和酶法[8]。近年來將超聲輔助提取技術(shù)在多糖提取工藝中應(yīng)用的越來越廣泛[9]。植物多糖提取過程主要包含兩個物理現(xiàn)象：細(xì)胞膜的通透性增大，多糖從細(xì)胞膜中滲出；細(xì)胞膜破裂后多糖從細(xì)胞中流出[10]。超聲波輔助提取主要是通過超聲波的空化作用和強(qiáng)烈振動使物體內(nèi)部產(chǎn)生振蕩、收縮，增加分子的運動頻率和速率，破碎原料細(xì)胞壁，促進(jìn)多糖的溶出，提高多糖的得率[11]。除了能夠提髙提取效率外，該方法還有縮短提取時間、減少試劑消耗和降低提取溫度等優(yōu)點，有利于保持熱穩(wěn)定性較差的有效成分的結(jié)構(gòu)和活性不被破壞[12]。

由于‘鳳丹’牡丹的經(jīng)濟(jì)價值，其種植面積將逐年擴(kuò)大[13]，但在實踐中，牡丹葉軸往往在采收種子后丟棄，不僅浪費資源，還對環(huán)境造成污染。有關(guān)優(yōu)化超聲輔助提取牡丹葉軸多糖工藝條件，尚未見相關(guān)報道，對其抗氧化活性也缺乏研究[14]。因此本試驗以‘鳳丹’牡丹葉軸作為試驗材料，通過單因素試驗和正交試驗，優(yōu)化超聲輔助提取‘鳳丹’牡丹葉軸多糖的最佳工藝，并對其抗氧化活性進(jìn)行評價，為更好地開發(fā)與利用‘鳳丹’牡丹葉軸提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2017年10月在鄭州采摘的七年生實生苗‘鳳丹’牡丹葉軸。選取生長旺盛、無病蟲害、長約35 cm，粗細(xì)均勻的葉軸，去除葉軸上的葉柄帶回實驗室備用。

無水乙醇、濃硫酸、過硫酸鉀、葡萄糖、半乳糖、木糖、果糖、蔗糖等（均為分析純）：Sigma 公司；2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]：合肥巴斯夫生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：阜陽曼林生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

智能溫控雙頻超聲波合成/萃取儀（XH-2008DE）：北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；新世紀(jì)紫外可見分光光度計（T6）：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9140）：上海一恒科技儀器有限公司；電子天平（JA3003N）：上海菁海儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-S8）：上海越磁電子科技有限公司；旋風(fēng)磨（FOSS SCINO CT410）：杭州嘉維創(chuàng)新科技有限公司；超純水機(jī)（minI）：湖南科爾頓水務(wù)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 混標(biāo)糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

參考王婉冰等[15]的方法，有改進(jìn)。用天平稱取50 mg的混標(biāo)糖（葡萄糖、半乳糖、木糖、果糖、蔗糖，每種各10 mg）放入燒杯，加蒸餾水，攪拌，待溶解后定容至100 mL，取20 mL 再次定容至100 mL 備用。用移液槍分別量取含 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL 混標(biāo)糖體積的混合液于編號1 至8 號的試管中，分別補(bǔ)充蒸餾水，使每支試管的溶液體積均達(dá)到1.0 mL，蒽酮硫酸比色法[16]測吸光度，擬合線性回歸方程。

1.3.2 牡丹葉軸多糖的測定

牡丹葉軸清洗干凈后置于干燥箱中，60 ℃烘干至恒重，用旋風(fēng)磨將其粉碎后過50 目篩；稱1.0 g 牡丹葉軸粉末加入相應(yīng)的蒸餾水?dāng)嚢杈鶆?，用超聲波萃取器進(jìn)行提取，將提取液過濾，4 000 r/min 離心10 min 后，取上清液備用。按1.3.1 的方法進(jìn)行測定，重復(fù)3 次，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其多糖得率：

式中：C 為提取液中多糖的濃度，mg/mL；V 為提取上清液體積，mL；N 為稀釋倍數(shù)；m 為樣品質(zhì)量，g。

1.3.3 牡丹葉軸多糖提取的單因素試驗

在液料比為 20 ∶1（mL/g）、超聲時間為 40 min、超聲功率為250 W 的條件下，考察超聲溫度為20、30、40、50、60、70 ℃對多糖得率的影響。

在超聲溫度為50 ℃、超聲時間為40 min、超聲功率為 250 W 的條件下，考察液料比為 8 ∶1、12 ∶1、16 ∶1、20 ∶1、24 ∶1、28 ∶1（mL/g）對多糖得率的影響。

在超聲溫度為 50 ℃、液料比為 20 ∶1（mL/g）、超聲功率為250 W 的條件下，考察超聲時間為10、20、30、40、50、60 min 對多糖得率的影響。

在超聲溫度為 50 ℃、液料比為 20 ∶1（mL/g）、超聲時間為40 min 的條件下，考察超聲功率為100、150、200、250、300、350 W 對多糖得率的影響。

1.3.4 ABTS+自由基清除率測定

參考朱玉昌等[17]的方法，有改動。稱ABTS 0.096 g，用蒸餾水定容至25 mL，稱0.3784 g 過硫酸鉀，用蒸餾水定容至 10 mL，量取 5 mL 的 ABTS 溶液與 88 μL 的過硫酸鉀溶液混合均勻，在室溫（25 ℃）避光的條件下靜置過夜，制成ABTS+自由基儲備液，在12 h～16 h 之內(nèi)測定，測定時用無水乙醇稀釋，使其在734 nm 波長下的吸光度為0.7±0.02。將樣品液及VC標(biāo)準(zhǔn)品配制成500、250、125、62.5、31.25、15.375、7.687 5 μg/mL 的樣品液。分別取各濃度的樣品液0.2 mL，加入3 mL ABTS+自由基儲備液，充分混合，室溫放置20 min 用紫外分光光度計在734 nm 處測定吸光值；空白管用蒸餾水替代樣品液。以抗壞血酸（VC）作為陽性對照。重復(fù)3 次。按照以下公式計算清除率：

式中：A空白為蒸餾水代替樣品液所測得吸光值；A樣品為樣品溶液所測得吸光值。

1.3.5 DPPH 自由基清除率測定

參考孫麗萍等[18]的方法，有改動。精確取0.019 7 g的DPPH 粉末，用無水乙醇溶解定容至250 mL，配制成0.2 mmol/L 的DPPH 自由基儲備液，0 ℃保存。將樣品液及 VC標(biāo)準(zhǔn)品配制成 500、250、125、62.5、31.25、15.375、7.6875 μg/mL 的樣品液。分別取各濃度的樣品液 0.5 mL，加入 2.5 mL 的 DPPH 自由基儲備液，在 28 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min，用紫外分光光度計于517 nm處測定吸光度，以抗壞血酸（VC）作為陽性對照。重復(fù)3次。按照以下公式計算清除率：

式中：A空白為無水乙醇代替樣品液所得吸光值；A樣品為樣品溶液所測得吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)試驗的平均值，用Microsoft Excel 2010 進(jìn)行整理，用SPSS13.0 對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 混標(biāo)糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的混標(biāo)糖溶液以及其對應(yīng)的吸光度，所做的擬合線性方程為：y=0.822 4x+0.014 8，R2=0.993 5，式中：y 為吸光度值；x 為混標(biāo)糖含量（mg/mL）。

2.2 單因素試驗結(jié)果與分析

2.2.1 超聲溫度對‘鳳丹’牡丹葉軸多糖得率的影響

超聲溫度對‘鳳丹’牡丹葉軸多糖得率的影響見圖1。

圖1 超聲溫度對多糖得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic temperature on the polysaccharide yield

由圖1 可知，20 ℃到50 ℃的多糖得率隨著超聲溫度的升高而增大，當(dāng)超聲溫度為50 ℃時多糖得率為10.664 7 mg/g，達(dá)到最大，但是當(dāng)超聲溫度高于50 ℃時，多糖得率開始下降。這可能是由于多糖溶解度隨溫度的升高而增大；但當(dāng)溫度繼續(xù)升高時，由于多糖的熱不穩(wěn)定性而發(fā)生分解，多糖得率下降[19]。方差分析結(jié)果表明，超聲溫度為50 ℃時的多糖得率顯著（p＜0.05）大于其他處理水平的多糖得率。因此，超聲溫度以50 ℃為宜。

2.2.2 液料比對‘鳳丹’牡丹葉軸多糖得率的影響

液料比對‘鳳丹’牡丹葉軸多糖得率的影響見圖2。

圖2 不同液料比對多糖得率的影響Fig.2 Effect of different ratio of liquid to material on the polysaccharide yield

如圖2所示，液料比在 8 ∶1（mL/g）至 20 ∶1（mL/g）的范圍內(nèi)，多糖得率是不斷增加的。隨著液料比的升高，蒸餾水用量逐漸增大。當(dāng)液料比達(dá)到20 ∶1（mL/g）后，得率隨蒸餾水用量的增加而呈降低趨勢。當(dāng)蒸餾水增加時，其與蒸餾水的接觸面積增加，有利于多糖溶出。當(dāng)蒸餾水量過多時，蒸餾水會吸收超聲波的輻射，從而使細(xì)胞破壁作用降低，多糖得率趨于緩慢降低[20]。方差分析結(jié)果表明，液料比 20 ∶1（mL/g）時的多糖得率顯著（p＜0.05）高于其他處理水平。因此，液料比以 20 ∶1（mL/g）為宜。

2.2.3 超聲時間對‘鳳丹’牡丹葉軸多糖得率的影響

超聲時間對‘鳳丹’牡丹葉軸多糖得率的影響見圖3。

圖3 超聲時間對多糖得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the polysaccharide yield

由圖3 可知，10 min 到30 min 內(nèi)，多糖得率隨超聲時間的延長而增加，當(dāng)超聲時間達(dá)到30 min 時，多糖得率最大，為11.256 5 mg/g，繼續(xù)延長提取時間，多糖得率反而開始下降，可能是由于超聲時間過長，多糖在高溫下部分化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞[21]，最終影響多糖的得率。方差分析結(jié)果表明，超聲時間為30 min 時的多糖得率，顯著（p＜0.05）大于其他處理水平的多糖得率。因此，超聲時間以30 min 為宜。

2.2.4 超聲功率對‘鳳丹’牡丹葉軸多糖得率的影響

超聲功率對‘鳳丹’牡丹葉軸多糖得率的影響見圖4。

圖4 超聲功率對多糖得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the polysaccharide yield

由圖4 可以看出，在100 W 至250 W 范圍內(nèi)，隨超聲功率不斷增加，多糖得率也隨之增加，當(dāng)超聲功率超過250 W 時，多糖得率開始下降?？赡苁且驗樵谝欢ǔ暪β史秶鷥?nèi)，提高超聲功率有利于促進(jìn)細(xì)胞壁的破裂和溶液傳質(zhì)作用，從而提高了多糖得率；但較大的超聲功率產(chǎn)生出一定的剪切作用而使多糖組分中糖苷鍵斷裂，所以呈下降趨勢[22]。方差分析結(jié)果表明，超聲功率為250 W 時的多糖得率顯著（p＜0.05）高于其他處理水平。因此，超聲功率以250 W 為宜。

2.3 超聲輔助提取牡丹葉軸多糖正交試驗結(jié)果與分析

在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用L（934）正交試驗，對超聲溫度、液料比、超聲時間、超聲功率等4 個因素進(jìn)行優(yōu)化，正交試驗因素水平設(shè)計與試驗結(jié)果分別如表1、表2所示。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Orthogonal experimental factors and levels

表2 正交試驗設(shè)計與極差分析結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental design and range analysis results

由表2 可以看出，在所選取得的4 個單因素中，極差的大小順序依次為B＞C＞D＞A；說明對牡丹葉軸多糖得率影響最大的是液料比（B），超聲溫度（A）對牡丹葉軸多糖得率的影響最小。根據(jù)分析可以得到各個因素的最優(yōu)水平為A3B3C3D1，即在超聲溫度為60 ℃，液料比為24 ∶1（mL/g），超聲時間為40 min，超聲功率為200 W 時，‘鳳丹’牡丹葉軸多糖得率最大，按此工藝條件進(jìn)行3 次驗證試驗，得出最優(yōu)組合提取條件下的多糖得率為（11.328 8±0.525 3）mg/g，高于正交試驗中任一提取工藝組合的多糖得率。與傳統(tǒng)提取工藝[液料比為 20 ∶1（mL/g），不進(jìn)行超聲處理，浸泡 30 min 后直接過濾測定]的多糖得率（7.867 3 mg/g）相比，最優(yōu)組合提取的多糖得率比傳統(tǒng)提取工藝高43.998 6%。

方差分析結(jié)果見表3。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 The results of variance analysis

由表3 可知，超聲溫度、液料比、超聲時間和超聲功率4 個試驗因素均達(dá)到顯著（p＜0.05）水平，表明這4 個因素均顯著（p＜0.05）地影響到了多糖的得率。

2.4 牡丹葉軸多糖提取物對自由基的清除作用

2.4.1 牡丹葉軸多糖提取物對ABTS+自由基的清除能力

牡丹葉軸多糖提取物對ABTS+自由基的清除能力見圖5。

圖5 多糖提取物對ABTS+自由基的清除能力Fig.5 Scavenging ability of the polysaccharide extract on ABTS+free radical

ABTS 在反應(yīng)體系中被氧化，生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色ABTS+自由基，734 nm 處有特征吸收峰，加入自由基清除劑（如多糖類化合物、VC等）會使顏色減弱，吸光度減小，顏色變化的程度可反應(yīng)自由基清除劑清除自由基的能力[23]。由圖5 可知，在一定的濃度下，牡丹葉軸多糖提取物和VC對ABTS+自由基均具有較好的清除作用，并且隨著濃度的增加，對ABTS+自由基的清除效果越好。在試驗條件下，當(dāng)牡丹葉軸多糖提取物濃度在 500 μg/mL 和 VC濃度為 250 μg/mL 時清除率均達(dá)到了100%。分析得出牡丹葉軸多糖提取物和VC對ABTS+自由基清除率的 IC50分別為 19.316 7 μg/g 和31.430 4 μg/g。

2.4.2 牡丹葉軸多糖提取物對DPPH 自由基的清除能力

多糖提取物對DPPH 自由基的清除作用見圖6。

圖6 多糖提取物對DPPH 自由基的清除作用Fig.6 Scavenging effect of polysaccharide extract on DPPH free radical

DPPH 自由基是一種穩(wěn)定的含氮自由基，結(jié)構(gòu)中存在單電子，在乙醇溶液中顯深紫色，在517 nm 處有特征吸收。多糖類化合物多數(shù)都具有羥基，可以提供氧原子，與DPPH 自由基結(jié)構(gòu)中的孤對單電子配對，從而減少單電子數(shù)目，使吸收減弱，顏色變淺或者消失。根據(jù)顏色變化程度就可以判定自由基的清除程度[24]。由圖6 可知，牡丹葉軸中提取的多糖化合物對DPPH自由基的清除作用隨多糖提取物濃度的增加，其清除能力也逐漸加強(qiáng)，表明了牡丹葉軸多糖提取物對DPPH 自由基的清除能力與其濃度有著明顯的量效關(guān)系。在試驗條件下，當(dāng)牡丹葉軸多糖提取物濃度在500 μg/mL 時對DPPH 自由基清除率達(dá)到了89.567 9%。分析得出牡丹葉軸多糖提取物和VC對DPPH 自由基清除能力的 IC50分別為 39.330 0 μg/g 和 40.790 0 μg/g，牡丹葉軸多糖提取物和VC對DPPH 自由基清除能力相近。

3 結(jié)果與討論

本文使用超聲輔助提取‘鳳丹’牡丹葉軸中的多糖，考察了超聲溫度、液料比、超聲時間和超聲功率這4 個單因素對‘鳳丹’牡丹葉軸多糖得率的影響。通過正交試驗對超聲輔助提取‘鳳丹’牡丹葉軸多糖的條件進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳工藝條件是：超聲溫度為60 ℃，液料比為 24 ∶1（mL/g），超聲時間為 40 min，超聲功率為200 W 時，牡丹葉軸多糖得率為（11.328 8±0.525 3）mg/g。

通過對‘鳳丹’牡丹葉軸多糖提取物的體外抗氧化試驗可知，在試驗所選取的濃度范圍內(nèi)‘鳳丹’牡丹葉軸多糖提取物對ABTS+自由基、DPPH 自由基均有較強(qiáng)清除作用。當(dāng)牡丹葉軸多糖提取物濃度在500 μg/mL 時ABTS+自由基清除率達(dá)到了100%，牡丹葉軸多糖提取物對ABTS+自由基清除能力的IC50為19.316 7 μg/g；當(dāng)牡丹葉軸多糖提取物濃度在500 μg/mL 時對DPPH自由基清除率達(dá)到了89.567 9%，牡丹葉軸多糖提取物對DPPH 自由基清除能力的IC50為39.330 0 μg/g，牡丹葉軸多糖具有較強(qiáng)的抗氧化活性，是天然抗氧化劑的良好來源。