許真，楊瑞峰，*，張芳，劉宏偉

（1.鶴壁職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品工程學(xué)院，河南 鶴壁 458030；2.鶴壁市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測檢驗中心，河南 鶴壁 458030）

硒是人和動物必需的微量元素之一，是谷胱甘肽過氧化物酶的重要組成成分，具有清除自由基、防止衰老、防癌及增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用[1-2]。我國72%的地區(qū)屬于缺硒地帶[3]，硒攝入量不足，會引起多種疾病，如克山病、癌癥等[4]，嚴(yán)重危害人體健康。我國成人每天攝入的硒量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于人體正常需要量[5]。通過食用含有豐富硒元素的食物，對人體來說是一種安全有效地補(bǔ)硒方法。

葡萄（Vitis vinifera L.）是葡萄科葡萄屬木質(zhì)藤本植物，漿果，酸甜多汁，含有豐富的可溶性糖、酸、維生素、類黃酮、酚等多種營養(yǎng)物質(zhì)和抗氧化物質(zhì)，具有降低血小板凝聚、改善心腦血管循環(huán)、預(yù)防血栓、抗病毒、抗菌、抗氧化、增強(qiáng)免疫力等作用。

近年來，有關(guān)硒肥在農(nóng)作物、瓜果蔬菜中的應(yīng)用研究越來越多，但不同濃度外源硒在葡萄果實(shí)中的積累情況及對葡萄果實(shí)中物質(zhì)含量的影響少有報道。鑒于此，本試驗通過對開花期葡萄施用不同濃度的亞硒酸鈉（Na2SeO3）溶液，對其果實(shí)中總硒含量、營養(yǎng)物質(zhì)和抗氧化物質(zhì)含量進(jìn)行測定，以期為生產(chǎn)富硒葡萄提供科學(xué)合理的施硒方法，為提高葡萄品質(zhì)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試葡萄（品種為“巨峰”）：栽培于鶴壁市新鎮(zhèn)葡萄園試驗田。

福林-酚試劑、考馬斯亮蘭G-250：上海躍騰生物科技有限公司；茚三酮：深圳子科生物科技有限公司；硝酸（優(yōu)級純）、亞硒酸鈉、香草醛、亞硝酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉、酚酞、苯酚、濃硫酸均為分析純：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2000 型紫外分光光度計：上海尤尼可儀器有限公司；AFS-920 型雙道原子熒光光譜：北京吉天儀器有限公司；PAL-1 型折光儀：深圳市方源儀器有限公司；VERSMax 酶標(biāo)儀：Molecular Devices 公司；TP-114電子分析天平：賽多利斯儀器有限公司；TGL-16gR 型臺式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 葡萄栽培

試材為8年生巨峰，行距×株距=4 m×1 m，樹形為龍干形。于葡萄盛花期，開始進(jìn)行葉面噴施亞硒酸鈉溶液，每株噴施20 mL，設(shè)清水噴施為對照（CK）。試驗選擇硒濃度為 0、20、30、40、50、60 mg/L 共 6 個濃度處理，每架葡萄為一個處理小區(qū)，3 次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列。每隔15 d 噴施一次，直至采收前15 d 停止。土肥水和病蟲害防治為田間常規(guī)管理。

1.3.2 樣品預(yù)處理

在果實(shí)成熟期進(jìn)行采收。每架葡萄隨機(jī)選取10個果穗，從果穗的上、中、下3 個部位隨機(jī)采摘無病蟲害、無機(jī)械傷的30 粒果。采摘后進(jìn)行果皮分離，將果肉用封口袋包裝，直接放入液氮中-40 ℃保存，用于總硒、蛋白質(zhì)、游離氨基酸、可溶性固形物、總糖、可滴定酸、原花青素、總黃酮、總酚和維生素C 的含量測定。每份樣品平行測定3 次，取平均值。

1.3.3 測定方法

1）總硒含量測定[6]：稱取5 g 果肉于微波消解管中，加入16 mL 硝酸，消化過夜，用微波消解儀消解。用熒光光譜儀測定總硒含量。

2）蛋白質(zhì)含量測定[7]：葡萄果肉研磨，離心取上清液，加蒸餾水稀釋混勻，取適量稀釋液，加入考馬斯亮蘭G-250 染料試劑，在595 nm 處測定吸光光度。

3）游離氨基酸含量測定[8]：葡萄果肉研磨，離心取上清液，加醋酸鹽稀釋，在沸水浴中煮15 min，迅速在冷水中冷卻，在580 nm 處測定吸光度。

4）可溶性固形物含量測定[9]：取適量葡萄果肉研磨，用4 層紗布擠出汁液，用蒸餾水進(jìn)行稀釋，在折射儀棱鏡表面滴2 滴～3 滴稀釋液，進(jìn)行測定。

5）總糖含量測定[10]：取適量葡萄果肉，加入3 倍量蒸餾水，搗碎離心，取上清液，加蒸餾水稀釋150 倍，加入5%苯酚和濃硫酸混勻，室溫放置15 min，在酶標(biāo)儀上于490 nm 處測定吸光光度值。

6）可滴定酸含量測定[11]：取適量葡萄果肉加入等量蒸餾水，搗碎勻漿，置75 ℃～80 ℃水浴中加熱30 min，冷卻后搖勻過濾。以酚酞為指示劑，用0.1 mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定。以酒石酸的百分含量表示。

7）原花青素含量測定[12]：凍干樣品粉碎，加入80%甲醇溶液，離心后取上清液過濾，加入40 g/L 香草醛甲醇溶液，再加入濃鹽酸，混勻，室溫條件下，暗處放置15 h，在500 nm 波長處比色。

8）總黃酮含量測定[13]：凍干樣品粉碎，加入80 %甲醇溶液，振蕩20 h，離心10 min，取上清液過濾。取濾液與亞硝酸鈉溶液混合，加入六水氯化鋁混勻，再加入氫氧化鈉，充分混勻，在510 nm 波長處測定吸光度。

9）總酚含量測定[14]：葡萄果肉打漿、離心，取葡萄汁加蒸餾水稀釋。取稀釋后的樣品溶液加蒸餾水混勻，加入福林酚試劑、Na2CO3溶液，用蒸餾水定容，75 ℃水浴10 min，冷卻后在760 nm 處測其吸光度。

10）維生素C 含量測定[15]：取葡萄果肉研磨均勻后置于錐形瓶中，加入1%鹽酸溶液勻漿，加入蒸餾水，離心后取上清液，在243 nm 處測定吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS12.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，利用Microsoft Excel 2007 繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度硒處理對葡萄果實(shí)中總硒含量的影響

在一定外源硒施用濃度范圍內(nèi)，植物對硒的吸收能力隨硒濃度的增加而增大，但硒濃度過高時，植物對硒的吸收能力下降，嚴(yán)重時會對植物體造成不同程度的傷害[16]。不同濃度硒處理對葡萄果實(shí)中總硒含量的影響見圖1。

由圖1 可知，清水（CK）噴施時，果實(shí)中硒含量非常低，為5.74 μg/kg，隨著噴施硒濃度的增加，葡萄果實(shí)中硒含量呈上升趨勢，當(dāng)硒濃度為60 mg/L 時，果實(shí)中的硒含量達(dá)最大值，為25.85 μg/kg；濃度為50 mg/L時，硒含量為25.48 μg/kg。說明施硒能提高葡萄果實(shí)中的硒含量，但果實(shí)對硒的吸收具有飽和性，當(dāng)外源硒達(dá)到一定濃度時，果實(shí)中的硒含量不再增加，多余的硒可能被輸送到植株的其它部位。

圖1 不同濃度硒處理對葡萄果實(shí)中總硒含量的影響Fig.1 Effect of different selenium treatments on selenium content of grape fruit

2.2 不同濃度硒處理對葡萄果實(shí)抗氧化物質(zhì)含量的影響

葉面噴施不同濃度硒處理對葡萄果實(shí)中抗氧化物質(zhì)如：原花青素、總黃酮、總酚和維生素C 的含量影響如表1所示。

表1 不同硒濃度處理對葡萄果實(shí)中抗氧化物質(zhì)含量的影響Table 1 Effect of different selenium treatments on antioxidant substances content in grape fruit

2.2.1 對原花青素含量的影響

原花青素（proantho anthocyan，PA）又叫縮合單寧，是廣泛存在于高等植物界中的一類聚多酚化合物，具有強(qiáng)大的清除自由基、抗氧化能力[17]。由表1 可知，隨著硒濃度的增加，葡萄果實(shí)中原花青素含量越來越高。硒濃度為60 mg/L 時原花青素含量最高，為0.91 μg/g，比對照提高了127.5%，與50 mg/L 時的含量變化差異不顯著。這與原花青素合成途徑有關(guān)，原花青素合成經(jīng)歷公共苯丙烷途徑→核心類黃酮-花青素途徑→PA特異途徑[18]，而苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）是苯丙烷途徑的第一個關(guān)鍵酶，由于PAL 活性與植物體中硒含量有極顯著的正相關(guān)性[19]，所以提高硒含量可以提高PAL 的活性[19]，PAL 活性增強(qiáng)，原花青素含量相應(yīng)增加。

2.2.2 對總黃酮含量的影響

由表1 可知，葡萄果實(shí)中總黃酮的含量隨硒溶液濃度的增加而升高，硒濃度為50 mg/L 時，總黃酮含量達(dá)最大值228.6 mg/100 g，比對照提高了7.6%；硒濃度為60 mg/L 時，總黃酮含量有所下降。其原因是黃酮類化合物由苯丙烷類代謝途徑產(chǎn)生，PAL 催化苯丙烷類代謝的第一步，與黃酮類化合物的生成有密切關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，硒含量增加，PAL 活性增強(qiáng)，總黃酮含量上升，硒含量過高時促進(jìn)其它次生代謝產(chǎn)物合成，不利于黃酮類物質(zhì)合成[19]，所以60 mg/L 時，總黃酮含量反而下降。

2.2.3 對總酚含量的影響

酚類物質(zhì)通過調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)，有效抑制或清除活性氧自由基，起到抗氧化作用[20]。由表1 可知，葡萄果實(shí)中的總酚含量隨硒濃度的增加而逐漸升高，與對照相比，分別提高1.5%、3.4%、5.8%、9.4%和9.2%，硒濃度為50 mg/L 時，總酚含量達(dá)最大值。這是因為PAL 是連接初級代謝和苯丙烷、苯丙氨酸類代謝的關(guān)鍵酶，參與酚類物質(zhì)的合成。PAL 活性增高，酚類物質(zhì)含量呈一致性增加[21]，而PAL 的活性與硒含量呈正相關(guān)性，所以增加硒濃度可以促進(jìn)果實(shí)中酚類物質(zhì)的合成和積累。

2.2.4 對維生素C 含量的影響

維生素C 是一類存在于植物綠色組織中的水溶性抗氧化物質(zhì)，在清除自由基，提高植物抗脅迫能力方面具有重要意義[22]。從表1 可以看出，隨著硒濃度的增加，果實(shí)中維生素C 含量也逐漸升高，濃度為60 mg/L 時達(dá)最大值6.25 mg/100g，比對照提高了37.1%，這可能是因為在適量范圍內(nèi)，硒被吸收后會形成硒蛋白，提高植物的合成代謝能力，維生素C 合成量隨之增加。

2.3 不同濃度硒處理對葡萄果實(shí)營養(yǎng)物質(zhì)含量的影響

葉面噴施不同濃度硒處理對葡萄果實(shí)中蛋白質(zhì)、游離氨基酸、可溶性固形物、總糖和可滴定酸等營養(yǎng)物質(zhì)的含量影響如表2所示。

表2 不同硒濃度處理對葡萄果實(shí)中營養(yǎng)物質(zhì)含量的影響Table 2 Effect of different selenium treatments on nutrient substances content in grape fruit

2.3.1 對蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量的影響

由表2 可知，隨著施硒濃度的增加，葡萄果實(shí)中蛋白質(zhì)含量呈上升趨勢，游離氨基酸含量逐漸下降。硒濃度為60 mg/L 時，蛋白質(zhì)含量達(dá)最大值129.3 mg/100 g，比對照提高了7.8%；游離氨基酸達(dá)最小值313.2mg/100g，比對照降低了3.5%，這與Munshi 等[23]的研究結(jié)果一致。硒素至少以2 種形式參與蛋白質(zhì)合成，一種是以原料的形式，轉(zhuǎn)換為硒代半胱氨酸、硒代胱氨酸等多種氨基酸，直接參與蛋白質(zhì)合成；另一種是硒為某種核糖核酸鏈的組成成分，該核糖核酸鏈的主要生理功能是轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸合成蛋白質(zhì)[24]。

2.3.2 對可溶性固形物含量的影響

可溶性固形物包括單糖、雙糖、多糖、酸、維生素和礦物質(zhì)等。由表2 可知，隨著硒濃度的增加，可溶性固形物含量逐漸增加，分別比對照提高了3.7%、7.1%、9.4%、10.6%和10.7%，硒濃度為50 mg/L 和60 mg/L時的總糖含量變化差異不顯著。由于硒元素參與植物體內(nèi)多種物質(zhì)代謝途徑，對植物的生長發(fā)育、光合作用以及礦物質(zhì)的吸收都有顯著影響[25-26]，所以，硒對葡萄果實(shí)中可溶性固形物含量的影響比較復(fù)雜，其作用機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

2.3.3 對總糖和可滴定酸含量的影響

由表2 可知，葡萄果實(shí)中總糖含量隨著硒濃度的增加而增大，硒濃度為50 mg/L 時，總糖含量最高，為123.83 g/L，比對照提高了17.2%，硒濃度為60 mg/L時，總糖含量變化不顯著。這可能是因為適量的硒能促進(jìn)光合作用和呼吸作用中電子的傳遞，促進(jìn)植物葉綠素合成，從而促進(jìn)植物的光合作用[25]，光合速率加快，光合產(chǎn)物增加，總糖含量增加。

外源硒對可滴定酸的含量影響不大。隨著硒濃度的增加，可滴定酸含量稍有降低，但不顯著，這是否與硒濃度有關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

由試驗結(jié)果可知，一定濃度范圍內(nèi)，隨著硒濃度的增加，葡萄果實(shí)對硒的吸收不斷增加；原花青素、總黃酮、總酚、維生素C、蛋白質(zhì)、可溶性固形物、總糖含量呈上升趨勢，且施硒濃度為50 mg/L 和60 mg/L 時的各測定指標(biāo)含量差異不顯著；游離氨基酸含量逐漸下降，可滴定酸含量變化不顯著。因此，在栽培中可噴施濃度為50 mg/L 的硒溶液，提高葡萄果實(shí)中的硒和營養(yǎng)物質(zhì)及抗氧化物質(zhì)含量，豐富葡萄有益成分。