豬流行性腹瀉免疫抗體的ELISA檢測及其與瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)相關(guān)性分析

潘孝成，芮聰杰，沈?qū)W懷，趙瑞宏，戴 銀，胡曉苗，侯宏艷，周學(xué)利，張丹俊

（1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽 合肥 230031；2.安徽省畜禽疫病研究中心，合肥 230031；3.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230061）

豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，為單股正鏈有囊膜的RNA病毒，其可導(dǎo)致豬的一種以水樣腹瀉、嘔吐和脫水為特征的傳染病，尤其哺乳仔豬受害最嚴(yán)重，1971年首次在英國發(fā)現(xiàn)豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea,PED）[1]，我國內(nèi)地自20世紀(jì)80年代初以來陸續(xù)有關(guān)于PEDV分離和鑒定的報(bào)道[2]，2010年底開始，PED在我國呈暴發(fā)性流行，2011—2012年流行面積進(jìn)一步擴(kuò)大，疫情繼續(xù)蔓延，一些地區(qū)流行較為嚴(yán)重[3-5]，2013年、2014年豬流行性腹瀉更是肆虐全球，美國、墨西哥、中國臺灣、日本、加拿大、多米尼加共和國、哥倫比亞、秘魯、韓國、烏克蘭等國家和地區(qū)也相繼暴發(fā)豬流行性腹瀉疫情[6-7]，給世界養(yǎng)豬生產(chǎn)者造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來豬流行性腹瀉在我國呈現(xiàn)常態(tài)化，在秋、冬、春季十分常見，其危害仍然較重[8]。

目前，我國對豬流行腹瀉的防控主要是采用疫苗免疫，市場上的商品化疫苗主要有豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)滅活疫苗和活疫苗以及豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉、豬輪狀病毒病三聯(lián)活疫苗3種，其中所用豬流行性腹瀉病毒的毒株不盡相同，各家豬場對豬流行腹瀉的免疫采用疫苗和免疫程序也不完全相同。本研究對不同地區(qū)的5家規(guī)模豬場的母豬初乳的豬流行性腹瀉病毒IgA抗體水平進(jìn)行了ELISA檢測分析，并對流行性腹瀉病毒抗體的ELISA和瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（瓊擴(kuò)試驗(yàn)）檢測結(jié)果的相關(guān)性進(jìn)行了研究，旨在為豬流行性腹瀉防控提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2019年1—3月在安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)所/安徽省畜禽疫病研究中心進(jìn)行。

1.2 主要試劑和材料

豬流行性腹瀉病毒IgA抗體ELISA檢測試劑盒，韓國安捷公司Bionote公司生產(chǎn)（生產(chǎn)批號：EB4410PO）；豬流行性腹瀉病毒瓊擴(kuò)抗原，安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)研究室制備并保存。

1.3 樣本采集和處理

采集免疫過豬流行性腹瀉疫苗的母豬初乳樣本，用1.5 mL高壓滅菌消毒離心管自哺乳期母豬身上采集產(chǎn)后3 d內(nèi)的初乳樣本，每頭豬采集不少于500 μL乳汁，共采集樣本數(shù)為454份，來自5家大規(guī)模豬場，分別是河南省漯河市源匯區(qū)和信陽市平橋區(qū)的2家豬場，安徽省定遠(yuǎn)縣和肥東縣的2家豬場，江蘇省泗洪縣的1家豬場。將乳汁樣本4℃12 000 r/min離心3 min，取上清液，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 ELISA檢測

按照豬流行性腹瀉病毒IgA抗體ELISA檢測試劑盒說明書，對所有采集母豬初乳的PEDV IgA抗體進(jìn)行檢測。1）檢測的有效性：陰性對照平均OD450值（NCX）≤0.200，陽性對照平均 OD450值（PCX）≥0.500，上述任何一個(gè)值超出規(guī)定的范圍，則該試驗(yàn)被視為無效，所檢的樣品需要重新進(jìn)行檢測。2）判斷值=0.35+NCX。3）陽性結(jié)果：樣品OD450值＞判斷值；陰性結(jié)果：樣品OD450值＜判斷值。

1.5 瓊擴(kuò)檢測

用濃度0.01 mol/L、pH為7.4的PBS配制濃度1%的瓊脂糖凝膠，制備瓊擴(kuò)平板，瓊脂糖凝膠厚度為5～6 mm之間，用七孔梅花打孔器打孔。將瓊擴(kuò)抗原加入到7孔中的中間孔，將待測抗體做等比稀釋，稀釋倍數(shù)分別為 2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6，依次加入到周圍 6 孔中，加入瓊擴(kuò)抗原和待測抗體的量均為30 μL/孔，將瓊擴(kuò)平板于37℃溫盒中反應(yīng)24 h，讀取瓊擴(kuò)抗體效價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 不同豬場母豬乳汁中IgA抗體水平

收集來自河南、安徽、江蘇的5家大型豬場454份初乳樣本，將豬場分別命名為AK、XHZ、BD、MQ、NA，這5家豬場生產(chǎn)母豬免疫豬流行性腹瀉疫苗次數(shù)，除BD場為產(chǎn)前3次，其余為產(chǎn)前2次（4/5），見表1，不同豬場所用疫苗生產(chǎn)廠家和疫苗毒株也不盡相同。用豬流行性腹瀉病毒IgA抗體ELISA檢測試劑盒進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，5家豬場初乳中PEDV IgA抗體陽性率均較高，陽性率分別為94.00%、97.06%、98.00%、98.21%和100%，陽性率最高的是XHZ場，最低的是MQ場。XHZ和MQ場其母豬免疫次數(shù)相同，產(chǎn)前的第1次免疫時(shí)間不同；XHZ用的是PEDV活疫苗和滅活苗的組合；MQ全部用的是滅活苗免疫。5家豬場初乳中PEDVIgA抗體陽性平均OD450值分別為1.858 8、1.979 0、2.013 6、2.047 3和2.148 0，差異不顯著（P＞0.05），PEDV IgA抗體陽性平均OD450值最低的是生產(chǎn)母豬免疫次數(shù)最多的BD場，最高為AK場，見表2。

表2 不同豬場母豬初乳中PEDV IgA抗體ELISA檢測結(jié)果

2.2 ELISA與瓊擴(kuò)相關(guān)性檢測結(jié)果

為建立PEDV抗體的ELISA與瓊擴(kuò)檢測相關(guān)性，選擇ELISA檢測為PEDV IgA抗體陽性的初乳樣本，按OD450值大小分組用瓊擴(kuò)法檢測PEDV抗體并分析，所用PEDV瓊擴(kuò)抗原為本實(shí)驗(yàn)室制備的高濃縮純化抗原，每組檢測初乳樣本數(shù)為5個(gè)或6個(gè)。結(jié)果顯示，OD450值≤1.0的組別瓊擴(kuò)抗體檢測全部為陰性，OD450值為 1.1～1.4、1.5～1.8、2.1～2.7 和≥3.0的4個(gè)組別所測得瓊擴(kuò)幾何平均效價(jià)分別為1∶4.5、1∶12.1、1∶32 和 1∶36.8，可以看出抗體瓊擴(kuò)幾何平均效價(jià)與PEDV IgA ELISA抗體檢測試劑盒檢測所得的OD450值存在正相關(guān)性，即ELISA檢測OD450值高的，其瓊擴(kuò)幾何平均效價(jià)則相對較高。具體見表3。

表3 乳汁PEDV抗體的ELISA與瓊擴(kuò)相關(guān)性檢測結(jié)果

3 討論

PEDV屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬成員，各種年齡的豬都能感染發(fā)病，尤其哺乳仔豬受害最嚴(yán)重，發(fā)病率可達(dá)100%，病死率平均為50%，10日齡內(nèi)哺乳仔豬死亡率可高達(dá)90%，斷奶豬、肥育豬、母豬和種公豬雖然發(fā)病率也可達(dá)100%，但大多數(shù)病豬可康復(fù)，一般表現(xiàn)為持續(xù)4～6 d的水樣腹瀉，基本不出現(xiàn)死亡[3，9]。大量研究表明，初生仔豬主要通過母豬初乳中IgA抗體而獲得PED的被動(dòng)免疫保護(hù)，因此母源抗體中IgA抗體水平高低對保護(hù)初生仔豬抗PEDV感染極為關(guān)鍵[10-11]。

本研究對來自安徽、河南、江蘇的5家大型豬場免疫母豬初乳中PEDV IgA抗體水平進(jìn)行了檢測，初乳抗體陽性率均較高，陽性率為94.00%～100%，陽性樣品平均OD450值分別為1.858 8～2.148 0。從結(jié)果分析可知，生產(chǎn)母豬的免疫次數(shù)、疫苗種類和疫苗生產(chǎn)廠家對生產(chǎn)母豬初乳中PEDV IgA抗體水平無明顯影響。胡興義等[10]研究表明，產(chǎn)前采用豬流行性腹瀉三聯(lián)活疫苗和二聯(lián)滅活疫苗交替免疫的方式，比產(chǎn)前均用豬流行性腹瀉三聯(lián)活疫苗或二聯(lián)滅活疫苗進(jìn)行兩次免疫效果更好。王艷豐等[11]研究表明，生產(chǎn)母豬產(chǎn)前豬流行性腹瀉三聯(lián)活疫苗和二聯(lián)滅活苗組合使用，其初乳抗體平均陽性率（97.79%）高于生產(chǎn)母豬產(chǎn)前豬流行性腹瀉二聯(lián)滅活疫苗二次免疫組（90.69%）。結(jié)合本研究及胡興義等[10]、王艷豐等[11]研究結(jié)果，我們認(rèn)為生產(chǎn)母豬產(chǎn)前進(jìn)行一次豬流行性腹瀉活疫苗（豬流行性腹瀉三聯(lián)活疫苗或豬流行性腹瀉二聯(lián)活疫苗）加一次豬流行性腹瀉二聯(lián)滅活疫苗免疫，這可能是較為合理的豬流行性腹瀉產(chǎn)前免疫方式。

瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)是一種常用的抗體檢測方法，其具有操作簡便、成本低廉和儀器設(shè)備要求低等特點(diǎn)，適宜于基層獸醫(yī)和養(yǎng)殖場等使用。本研究結(jié)果表明抗體瓊擴(kuò)幾何平均效價(jià)與PEDV IgA ELISA抗體檢測試劑盒檢測所得的OD450值呈正相關(guān)性，雖然PEDV IgA ELISA檢測陽性且OD450值≤1.0的組別瓊擴(kuò)抗體檢測全部為陰性，但OD450值≤1.0的陽性樣本數(shù)只占到總陽性樣本數(shù)4.30%（數(shù)據(jù)結(jié)果中未列出），因此用瓊擴(kuò)法開展豬流行性腹瀉病的免疫抗體評價(jià)一定程度上可用于替代ELISA法，這具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。