龔方圓 - 王成秋,3,4 -,3,4 焦必寧,3,4 -,3,4張耀海,3,4 -,3,4 趙其陽,3,4 -,3,4 安 姣

(1. 中國農業(yè)科學院柑桔研究所，重慶 400712；2. 西南大學柑桔研究所，重慶 400712；3. 農業(yè)農村部柑桔產品質量安全風險評估實驗室，重慶 400712；4. 國家柑桔工程技術研究中心，重慶 400712)

高效氯氟氰菊酯(λ-cyhalothrin)是目前擬除蟲菊酯中殺蟲活性最高的品種之一；吡蟲啉(Imidacloprid)是全球用量最大、具有特殊殺蟲機制的煙堿類殺蟲劑。2種藥劑作為柑橘生產中的常用殺蟲劑，應用十分廣泛，但如果長期單一使用易形成抗藥性。研究[1]表明，2種農藥復配使用具有增效作用，能較好延緩抗性發(fā)生，并可有效減少使用劑量和次數(shù)以降低農藥殘留超標的風險。目前，國內外研究主要集中于高效氯氟氰菊酯在果蔬中的殘留動態(tài)消解[2-3]和微生物降解[4]以及吡蟲啉在果蔬中的殘留消解動態(tài)[5-6]方面，單劑或復配農藥在柑橘中的殘留及消解動態(tài)研究鮮見報道[7-8]，且已有結果因農藥劑型、柑橘品種等差異無法直接采用進而對柑橘種植進行合理指導。此外，高效氯氟氰菊酯與吡蟲啉雖毒性較低，但若超劑量使用或不按安全間隔期采收仍會在果實中存在殘留，危害人體健康，故有必要對其可能產生的膳食攝入風險進行評估。

本研究擬采用QuEChERS前處理技術結合超高效液相色譜—串聯(lián)質譜儀(UPLC-MS/MS)同時檢測柑橘中高效氯氟氰菊酯和吡蟲啉的殘留，對33%氯氟·吡蟲啉懸浮劑在2年(2016～2017年)3地(中國重慶、湖南和廣西)柑橘田殘試驗的殘留消解動態(tài)規(guī)律進行研究，并就試驗結果對6類典型人群進行膳食風險評估，以期對合理、安全使用33%氯氟·吡蟲啉懸浮劑提供可行的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試農藥

33%氯氟·吡蟲啉懸浮劑：市售。

1.1.2 供試作物

溫州蜜柑：宮川，產地中國重慶、湖南和廣西。

1.1.3 試劑及標準品

高效氯氟氰菊酯、吡蟲啉標準品：純度99.0%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；

乙酸銨：分析純，成都市科龍化工試劑廠；

乙腈、甲醇：色譜純，德國CNW Technologies GmbH公司；

無水硫酸鎂、氯化鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

甲酸、乙酸：分析純，重慶川東化工有限公司；

乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、超純反相C18填料：加拿大SiliCycle公司；

石墨化碳黑(GCB)：德國 CNW Technologies GmbH公司。

1.1.4 儀器設備

超高效液相色譜—串聯(lián)質譜儀：Agilent 1290-6495 型，美國Agilent公司；

超純水儀：Milli-Q A10型，美國Millipore公司；

多用途離心機：CL31/CL31型，美國Thermo Fisher公司；

數(shù)控超聲波清洗器：KQ5200DE型，昆山市超聲儀有限公司；

1.2 試驗方法

1.2.1 田間試驗設計 試驗于2016～2017年在中國重慶北碚、湖南張家界、廣西崇左3地進行，試驗設計參照《農藥殘留試驗準則》[9]。殘留動態(tài)試驗施藥劑量為495 mg/kg (以1.5倍推薦劑量作為消解動態(tài)試驗的施藥量)，施藥1次，施藥后2 h和1，3，7，10，14，21，30，45 d分別采集樣品測定；最終殘留試驗根據(jù)推薦劑量，以33%氯氟·吡蟲啉懸浮劑的1 000倍稀釋液(330 mg/kg)為低劑量、500倍稀釋液(495 mg/kg)為高劑量噴施2和3次，施藥間隔期10 d，各處理組設3個重復，自最后一次噴藥當天起間隔21，28，35 d采集樣品測定。試驗期間天氣以晴或多云為主，部分地區(qū)存在陣雨或中到小雨，大風天或預計1 h內降雨延后施藥。

1.2.2 前處理方法 參照文獻[10]并略作修改。準確稱取5 g已勻漿的柑橘全果、果肉、果皮樣品(果皮樣品預先加入2.5 mL水)，置于50 mL離心管中，加入10 mL 1%乙酸—乙腈，超聲波提取25 min，加入2.0 g無水MgSO4和0.5 g NaCl，劇烈振蕩1 min，以10 000 r/min離心5 min。移取2 mL上清液于已加入50 mg PSA的4 mL離心管中，渦旋振蕩處理1 min后以3 000 r/min離心5 min，移取上清液經有機濾膜(0.22 μm)過濾，待測。

1.2.3 儀器檢測條件

(1) 超高效液相色譜條件：Agilent ecipes plus C18液相色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)；柱溫40 ℃；進樣量3 μL；流速0.3 mL/min；流動相(A)為0.1% 甲酸水溶液(5 mmol/L乙酸銨)，流動相(B)為甲醇，梯度洗脫6 min，其中，0～2 min，VA∶VB(流動相A與流動相B的體積比)為9∶1；2～6 min，VA∶VB為1∶9。

(2) 質譜條件：采用電噴霧離子源正離子模式(ESI+)掃描方式和多反應離子監(jiān)測模式(MRM)；干燥氣流速14 L/min，干燥氣溫度250 ℃；氮氣壓力206.84 kPa；鞘氣流速12 L/min，鞘氣溫度375 ℃；保留時間、檢測離子、駐留時間、錐孔電壓及碰撞能量參數(shù)見表1。

表1 高效氯氟氰菊酯、吡蟲啉各檢測參數(shù)?

? *定量離子。

1.3 膳食暴露及風險評估

膳食暴露及風險評估[11]主要用來評價日常生活中可能接觸的暴露途徑和劑量，明確可能遭受危害的敏感人群及實際和預期暴露的劑量水平。本研究僅以柑橘為單一農藥殘留的暴露途徑，基于殘留試驗所得數(shù)據(jù)進行慢性攝入風險評估。慢性攝入風險采用風險商(RQ)按式(1)、(2)計算：

(1)

(2)

式中：

EDI——日估算攝入量，mg/(kg BW·d)；

螺釘斷裂者，如骨折愈合可行內固定取出；如骨折未愈合而無明顯不適可佩戴胸腰背支具外固定至骨折愈合；如存在胸腰背部疼痛不適，應行開放手術翻修并增加傷椎固定。

STMR——農產品規(guī)范試驗殘留中值，mg/kg；

F——農產品消耗量，kg/d；

bw——某一人群平均體重，kg；

ADI——日允許攝入量，mg/(kg BW·d)。

當RQ≤1時，表示存在的慢性風險在可接受范圍內；當RQ>1時，表示存在不可接受的慢性風險。RQ值越小，風險越小，反之則越大。不同性別及年齡人群的體重水平和水果消耗量采用文獻[11]發(fā)布的數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 9.1進行數(shù)據(jù)處理，試驗數(shù)據(jù)結果采用指數(shù)回歸方程進行擬合。消解半衰期T1/2按式(3)、(4)計算：

Ct=Co×e-kt，

(3)

(4)

式中：

Ct——時間為t時果實中農藥殘留量，mg/kg；

Co——果實中農藥初始殘留量，mg/kg；

t——采樣時間，d；

k——消解速率常數(shù)；

T1/2——消解半衰期，d。

2 結果與分析

2.1 方法的準確度、精密度和檢出限

在優(yōu)化后的分析條件下，高效氯氟氰菊酯和吡蟲啉在不同基質中的檢出限(LOD)為0.000 8～0.002 0 mg/kg，定量限(LOQ)為0.002～0.005 mg/kg，在0.2～2 000.0 μg/L時，峰面積與濃度間呈良好線性關系。取柑橘的空白樣品進行回收率試驗，高效氯氟氰菊酯和吡蟲啉，添加水平為0.01，0.10，1.00，2.00 mg/kg，每個水平設置5個重復，同時做空白對照，采用空白提取液配制的基質標樣進行定量。試驗結果表明：高效氯氟氰菊酯的回收率范圍為93.1%～107.0%，相對標準偏差為1.9%～7.9%，吡蟲啉的回收率范圍為85.2%～101.7%，相對標準偏差為1.9%～7.6%。方法精密度和準確度均符合農藥殘留分析的要求。

2.2 殘留動態(tài)試驗

2.2.1 高效氯氟氰菊酯和吡蟲啉的殘留消解動態(tài) 柑橘果實中的殘留消解動態(tài)見圖1，施藥2 h后，高效氯氟氰菊酯和吡蟲啉初始沉積量分別為0.190～0.380，1.209～1.481 mg/kg，之后殘留量逐漸減少。消解規(guī)律均符合一級動力學關系，動力學方程、擬合優(yōu)度、半衰期等見表2。施藥45 d后，高效氯氟氰菊酯和吡蟲啉最終降解率均在92%以上。各地區(qū)的氣候因素可能是造成殘留量及消解率差異的主要原因，如2017年重慶、湖南高效氯氟氰菊酯的初始殘留量約為2016年的2倍，可能是試驗前期兩地陣雨天氣較頻繁，雨水的沖刷作用極大地降低了高效氯氟氰菊酯的殘留量，而吡蟲啉因具有內吸性受到的影響較小。

目前，國內外關于高效氯氟氰菊酯、吡蟲啉單劑在柑橘中的殘留動態(tài)規(guī)律研究暫未見報道，其復配劑在柑橘中的殘留動態(tài)規(guī)律研究有少量報道：Kofi[7]研究顯示高效氯氟氰菊酯在柑橘中的半衰期為1～2 d；崔幸幸等[8]研究表明吡蟲啉在柑橘中的半衰期為3.38 d。已有研究中劑型、柑橘品種等存在差異，且復配劑之間的相互作用或地區(qū)環(huán)境之間的差異也可能會造成兩者半衰期的差別，故無法對兩者的結果進行深入比較。因此，本研究的試驗結果填補了高效氯氟氰菊酯和吡蟲啉單劑或復配劑在柑橘中的殘留動態(tài)研究方面的空白，是對該類藥劑在農業(yè)種植方面合理安全使用技術的一個補充和延伸。

2.2.2 最終殘留試驗 表3表明：高效氯氟氰菊酯和吡蟲啉在柑橘中的最終殘留量與施藥劑量、施藥次數(shù)及采收間隔呈正相關。這與Sun等[12]研究的螺螨酯在柑橘上的最終殘留規(guī)律及Chen等[13-14]研究的2,4-D與氯吡脲在柑橘上的最終殘留規(guī)律一致。兩種有效成分在柑橘中的殘留量總體呈：果皮>全果>果肉，大部分仍舊存留在果皮中，這可能是殘留物在表皮變干燥并以附著物的形式存于果皮表面或者結合到柑橘皮外部中的蠟質物質中積聚起來導致的[12]，此外滲透作用[15]和酶促變化[16]可能致使少量高效氯氟氰菊酯與吡蟲啉進入到果肉中。距末次施藥28 d后，所有處理組柑橘全果中吡蟲啉和高效氯氟氰菊酯的殘留量均低于國家標準(GB 2763—2016)中規(guī)定的MRL值，中國農藥信息網的已登記的數(shù)據(jù)顯示[17-18]：高效氯氟氰菊酯單劑在柑橘上的采收安全間隔期為21 d、吡蟲啉在柑橘上的單劑的采收安全間隔期為14 d。與單劑相比，吡蟲啉與高效氯氟氰菊酯復配后安全間隔期有一定程度延長，表明復配可以延長藥劑的持效期，這對于柑橘的農業(yè)生產具有一定指導意義。

圖1 33%氯氟·吡蟲啉懸浮劑有效成分在柑橘中的殘留動態(tài)

分析物時間試驗地消解動態(tài)方程擬合優(yōu)度R半衰期/d高效氯氟氰菊酯2016年2017年重慶y=0.325 5e-0.08x0.984 28.7湖南y=0.378 1e-0.075x0.985 59.2廣西y=0.361 2e-0.076x0.934 59.1重慶y=0.142 6e-0.085x0.956 08.2湖南y=0.233 0e-0.079x0.978 28.8廣西y=0.185 7e-0.071x0.933 89.8吡蟲啉 2016年2017年重慶y=1.246 4e-0.091x0.987 46.9湖南y=1.232 2e-0.085x0.991 55.5廣西y=1.816 2e-0.079x0.949 36.8重慶y=0.822 3e-0.075x0.981 77.6湖南y=0.974 4e-0.07x0.992 66.8廣西y=0.853 7e-0.082x0.982 46.6

2.3 風險評估

GB 2763—2016中規(guī)定高效氯氟氰菊酯和吡蟲啉的日允許攝入量(ADI)分別為0.02，0.06 mg/(kg·BW)。不同人群食物攝入量與其體重的比值各不相同，由此造成的膳食攝入暴露量對各人群的風險也存在較大差異。因此，本研究選擇6類人群，即2～4，18～30，60～70歲的男性和女性為典型代表進行膳食暴露風險評估[11]。根據(jù)文獻[11]中的體重和膳食調查數(shù)據(jù)及本研究殘留試驗所獲數(shù)據(jù)進行計算，結果見表4。結果表明：在3個不同采收間隔期(21，28，35 d)，中國各類人群柑橘中高效氯氟氰菊酯和吡蟲啉的估計每日攝入量(EDI)分別為0.000 0～0.000 4，0.000 0～0.000 2 mg/(kg BW·d)。柑橘中高效氯氟氰菊酯、吡蟲啉殘留對上述6類人群的風險商均在0.020 以下，表明在柑橘上合理使用高效氯氟氰菊酯與吡蟲啉對消費者的膳食健康風險較低，對人體的風險均在可接受范圍內。

表3 高效氯氟氰菊酯、吡蟲啉在柑橘全果、果肉、果皮中的最終殘留情況

表4 不同采收間隔期條件下高效氯氟氰菊酯和吡蟲啉的膳食風險評估數(shù)據(jù)

但有一點必須指出的是，目前的膳食風險評估均是以某一食物為單一的農藥殘留暴露途徑基于規(guī)范殘留試驗數(shù)據(jù)進行的，而且絕大多數(shù)僅針對農藥單劑。復配劑是未來農藥發(fā)展的趨勢之一，鑒于目前農業(yè)生產者農藥施用行為具普遍性、殺蟲劑具廣譜高效性和普遍適用性以及農產品深加工等風險因素復配農藥在食物中的殘留風險評估不應只是針對各有效成分對人體造成的慢性攝入風險值的簡單加和，而應當在相關聯(lián)合毒性試驗基礎上對膳食風險評估數(shù)據(jù)進行修正，但目前關于多種農藥聯(lián)合毒性的研究暫未形成系統(tǒng)且亟待補充。

3 結論

33%氯氟·吡蟲啉懸浮劑的殘留消解試驗表明，高效氯氟氰菊酯和吡蟲啉在柑橘中的殘留動態(tài)符合一級動力學消解模式，半衰期分別為8.2～9.8，5.5～7.6 d，最終降解率均在92%以上；最終殘留量表明最終殘留量與施藥劑量、施藥次數(shù)及采收間隔期呈正相關；2種有效成分的殘留主要分布于果皮，其次為全果和果肉；距末次施藥28 d后，柑橘全果中吡蟲啉和高效氯氟氰菊酯的殘留量均低于國家標準(GB 2763—2016)中規(guī)定的MRL值，膳食風險評估結果表明，其殘留對6類典型人群的風險均在人體可接受范圍內。因此建議33%氯氟·吡蟲啉懸浮劑以1 000倍稀釋液(330 mg/kg)施藥，1個柑橘生產周期最多施藥2次，施藥間隔期10 d，采收安全間隔期為28 d 對柑橘種植進行技術指導。

但本研究的分析檢測僅針對原藥母體，未涉及高效氯氟氰菊酯多種異構體及吡蟲啉各代謝物的分析檢測。研究表明，高效氯氟氰菊酯不同異構體[19]及吡蟲啉各代謝物[20]對人體也可能存在毒性作用，為了降低農產品中農藥殘留的潛在風險，減輕人體內的農藥殘留威脅，需進一步加強對多類型農藥的同時檢測及其異構體和代謝物的檢測研究。此外，目前的膳食風險評估通常以某一食物為單一農藥殘留暴露途徑、基于規(guī)范殘留試驗數(shù)據(jù)進行，且絕大多數(shù)僅針對農藥單劑，為準確進行農產品中農藥殘留的膳食風險評估，需對多種農藥聯(lián)合毒性的進行系統(tǒng)研究且亟待進一步補充。