康展榮 傅聲揚 俞斌 丁惠鋒， 胡健 禹寶慶 黃建明

1 復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院骨科（上海201399）

2 上海理工大學(xué)材料與工程學(xué)院（上海200093）

3 復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院，上海市公共衛(wèi)生臨床中心，骨科（上海200032）

前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）損傷是最常見的膝關(guān)節(jié)韌帶損傷，多發(fā)生于青少年、運動員和經(jīng)常參加體育鍛煉的人群。文獻報道，每年ACL 斷裂的發(fā)生率在30～78/10 萬人[1]。由于ACL 血管化[2，3]和自愈能力差[4]，斷裂后如不及時治療會繼發(fā)半月板損傷，破壞關(guān)節(jié)軟骨[5]，引發(fā)創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎。ACL 重建可以很好地恢復(fù)膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定性[6]，是目前ACL斷裂后的主要治療方法。ACL 重建常用的材料有自體移植物、異體移植物和人工合成移植物。自體移植物存在手術(shù)時間長、供區(qū)損傷并發(fā)癥、來源不足等缺陷，而異體移植物術(shù)后愈合時間較長，有傳播疾病、引發(fā)免疫排斥的風(fēng)險[7]，異體移植物往往需要經(jīng)輻射或化學(xué)滅菌，使其術(shù)后失敗率也大大增加[8]。LARS（ligament advanced reconstruction system）韌帶是目前臨床上應(yīng)用最多的人工移植物，其主要成分是聚對苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate，PET）。近年來，短期、中期和長期臨床研究[9-11]結(jié)果表明，PET 韌帶的治療效果與自體移植物相似，甚至優(yōu)于自體移植物，而且具有材料容易獲得、手術(shù)時間短、術(shù)后恢復(fù)快[3，12]等優(yōu)勢。然而，PET 材料的疏水性能是PET 韌帶的一個主要缺陷[13]，這使得PET 韌帶的細胞相容性較差，不利于細胞在其表面黏附、增殖以及血管的再生，導(dǎo)致韌帶與宿主骨之間的接合不緊密，增加手術(shù)失敗的風(fēng)險。大量的研究表明，對PET移植物的表面進行涂層修飾，可以改善PET的疏水性能，促進細胞在其表面的黏附、增殖和成骨分化[14，15]，體內(nèi)實驗也證實涂層修飾可以促進移植物與宿主骨之間的愈合[16-18]。

近年來，硅酸鈣（calcium silicate，CS）生物陶瓷在骨組織工程和再生修復(fù)領(lǐng)域引起了研究者的關(guān)注。CS具有較高的親水性[19]，CS釋放的鈣、硅離子能夠誘導(dǎo)并促進其表面羥基磷灰石層的形成，因而具有良好的生物學(xué)活性[20，21]。研究表明，CS 在體外能夠促進成骨相關(guān)細胞的增殖分化，體內(nèi)能夠與宿主骨直接接合，促進骨組織再生[22，23]。在CS中加入（摻入）金屬元素和（或）金屬氧化物之后，得到的復(fù)合硅酸鈣生物陶瓷（doped calcium silicate bioceramics，DCSBCs）的生物學(xué)性能得到進一步提升。有研究表明在硅酸鈣材料中加入鈦、鋯等活性離子，可以明顯提高其生物活性和力學(xué)性能[24，25]。因此，DCSBCs 在骨再生修復(fù)領(lǐng)域有著巨大的開發(fā)潛力和應(yīng)用前景。鈰（cerium，Ce）是一種稀土元素，目前被廣泛應(yīng)用于催化、燃料電池和微電子等工業(yè)領(lǐng)域。研究發(fā)現(xiàn)，納米氧化鈰（CeO2）具有抗氧化、抗炎、抗細胞凋亡和促進血管再生的功能。氧化鈰材料在骨、皮膚等領(lǐng)域的研究已有文獻報道[26，27]，3D打印制備的CeO2摻入的介孔硅酸鈣生物支架也被證實具有良好的促進骨再生的能力[28]。本研究將含鈰的硅酸鈣（Ce-CS）涂覆于PET人工韌帶表面，通過體外和體內(nèi)實驗來研究Ce-CS涂層對移植物-骨愈合的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 材料來源

臨床前交叉韌帶重建術(shù)后的LARS韌帶殘端。

1.1.2 材料處理和分組

將臨床ACL重建術(shù)后剩余的PET韌帶纖維于75%的酒精中浸泡4 h 去漬，然后用去離子水清洗3 遍，在37℃烘箱中烘干后，將PET 韌帶剪成與24 孔板或6 孔板孔徑大小相同的圓形。

制備10 mol%的含鈰硅酸鈣（Ce-CaSiO3）溶膠。將8.67 g Ca（NO3）2·4H2O、8.5 g原硅酸四乙酯（TEOS）和1.77 g Ce（NO3）3·6H2O在38℃下溶于130 ml蒸餾水和20.5 ml HCL溶液中，水浴24小時。

將裁剪好的PET 片浸入制備的溶膠溶液中，在磁力攪拌下浸泡5、15、30分鐘，浸漬處理的PET片為實驗組，未經(jīng)任何處理的PET 片為對照組。將所有PET 片在37℃烘箱中干燥備用。

1.1.3 主要試劑

Ca（NO3）2·4H2O、原硅酸四乙酯（TEOS）、Ce（NO3）3·6H2O、HCL 溶液（均由上海理工大學(xué)提供），α-MEM培養(yǎng)液（Hyclone 公司），胎牛血清（FBS，Gibco 公司），青-鏈霉素（Gibco 公司），0.25% Trypsin -EDTA 溶液（Gibco公司），CCK-8試劑盒（日本Dojindo公司），細胞裂解液（上海威奧生物公司），堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）檢測試劑盒（Beyotime 公司），Tri?tonX-100（Sigma 公司），SYBR GREEN PCR Master Mix（Life 公司），Trizol（Invitrogen 公司），QuantiTect Re?verse Transcription Kit（QIAGEN 公司），RNA 引物（ 上海生工公司），茜素紅染劑（Solarbio），氯化十六烷基吡啶（Amresco 公司），2.5%戊二醛（北京索萊寶公司），維生素C（北京索萊寶公司），地塞米松（北京索萊寶公司），β-甘油磷酸鈉（北京索萊寶公司）。

1.2 實驗動物

1.2.1 SD大鼠

4周齡、雄性SD大鼠2只（斯萊克公司）。

1.2.2 新西蘭大白兔

雄性、體重2.7 ± 0.5 kg的新西蘭大白兔12只。

1.3 方法

1.3.1 rBMSCs的提取和培養(yǎng)

將SD大鼠頸椎脫臼處死后，置于75%的乙醇中浸泡消毒5 min，剪去腹壁和后肢皮毛，取雙側(cè)股骨和脛骨，去除骨組織周圍的肌肉和軟組織，用預(yù)冷的PBS清洗3次；切除股骨、脛骨兩端的干骺端，暴露骨髓腔，用PBS 沖洗骨髓腔，收集沖洗液，1000 rpm，離心8 分鐘；配置細胞培養(yǎng)所需的完全培養(yǎng)基（α-MEM培養(yǎng)基中加入10% FBS 和1%青鏈霉素）；用完全培養(yǎng)基重懸離心得到的細胞沉淀，接種到培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)約7 天后細胞長至80%～90%，得到原代rBMSCs；rBMSCs 傳代培養(yǎng)，取傳至第4代的細胞進行實驗。

1.3.2 表面涂層及其性能檢測

將兩組的PET 韌帶噴金處理后，通過SEM 觀察材料表面形態(tài)，EDS分析材料表面的元素組成；材料表面的水接觸角實驗，檢測材料的親水性能。根據(jù)本部分實驗結(jié)果確定后續(xù)實驗中材料處理的時間。

1.3.3 細胞增殖檢測

在進行所有的細胞實驗之前，兩組PET 材料均經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌，在完全培養(yǎng)液中浸泡2小時后使用。

按1×104/孔的密度將rBMSCs 接種到24 孔板中的材料表面，在接種培養(yǎng)后的第1、3、7 天用CCK-8 試劑盒檢測細胞增殖活性。棄掉培養(yǎng)基，無血清的培養(yǎng)基清洗1遍，每孔加入40 μL CCK-8反應(yīng)液和360 μL無血清培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h。反應(yīng)結(jié)束后每孔吸取200 μL 轉(zhuǎn)移至96 孔板中，酶標(biāo)儀檢測450 nm 處的吸光度。

1.3.4 堿性磷酸酶（ALP）活性檢測

按1×104/孔的密度將rBMSCs 接種到24 孔板中的材料表面，待細胞融合至80%時，將培養(yǎng)基更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液（β-甘油磷酸鈉10 mM/L，維生素C50 μmol/L，地塞米松10-8mol/L），誘導(dǎo)培養(yǎng)7天、14天后檢測ALP 活性。棄掉培養(yǎng)基，PBS 清洗3 遍，每孔加入200 μL細胞裂解液，冰上裂解3 min，將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP 管中離心，上清液即為所需細胞蛋白溶液，然后按照說明書在96孔板中加入樣品和反應(yīng)試劑，最后測定405 nm 處的吸光度。BCA 法測定蛋白液中的蛋白濃度，用以標(biāo)準(zhǔn)化ALP活性值。

1.3.5 成骨基因表達檢測

按1×105/孔的密度將rBMSCs接種到6孔板中的材料表面，細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)7天、14天后，Trizol 法提取各組細胞的總RNA。根據(jù)產(chǎn)品說明書要求，以20 μL 反應(yīng)體系將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT-PCR 為20 μL 反應(yīng)體系：Master Mix 10 μl，F(xiàn)orward Primer 0.5 μL，Re?verse Primer 0.5 μL，cDNA 模板1 μL，ROX Refer?ence Dye 0.1 μL，ddH2O 7.9 μL。反應(yīng)條件為：95℃2min 預(yù)變性，95℃ 15 s，59℃ 60 s，共40 個循環(huán)。RNA 引物序列：OCN，F(xiàn) 5'-AGGAGGGCA ATAAGG?TAGTGAA-3'，R 5'-TACCATAGATGCGTTTGTAG?GC-3'；COL-1，F(xiàn) 5'-GAGGCATAAAGGGTCATCGT?GG-3'，R 5'-CATTAGGCGCAGGAAGGTCAGC-3'；GAPDH，F(xiàn) 5'-TTGTTCCCTGCGACTTCAACA-3'，R 5'-GTGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3'。

1.3.6 茜素紅染色

24孔板中的細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)21天后，棄掉培液，PBS清洗3 遍，4%多聚甲醛固定10 分鐘，0.5%茜素紅常溫染色30 分鐘，PBS 清洗至水清，顯微鏡下拍照。定量：每個樣品加入500 μL 10%氯化十六烷吡啶反應(yīng)1 小時，酶標(biāo)儀572 nm處測量吸光度。

1.3.7 兔關(guān)節(jié)外移植物-骨愈合模型建立

PET 韌帶剪成10 mm×5 mm 長方形，實驗組材料進行Ce-CS修飾。兔子稱重后，經(jīng)耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉，常規(guī)消毒鋪巾，在股骨內(nèi)側(cè)髁處作一長約3 cm 的縱行切口，逐層分離、切開至關(guān)節(jié)囊，暴露股骨內(nèi)髁骨面，在內(nèi)側(cè)髁中部用直徑2 mm克氏針鉆一深度約10 mm 的孔，將韌帶卷成圓柱狀塞入骨缺損處，材料末端留約2 mm長度，然后逐層縫合、關(guān)閉切口。同一只兔子左、右側(cè)對照，左側(cè)為對照組，右側(cè)為Ce-CS 處理組。術(shù)后肌肉注射青霉素50 萬U/只，連續(xù)3天，正常飼養(yǎng)條件下喂養(yǎng)。

1.3.8 Micro-CT和三維重建分析

韌帶植入8 周后，處死動物，取出雙側(cè)股骨，去除周圍肌肉和軟組織，進行Micro-CT掃描，對得到的數(shù)據(jù)進行三維重建，分析兩組骨缺損處新骨再生情況。

1.3.9 組織學(xué)染色

取材后的股骨經(jīng)4%多聚甲醛固定后，依次進行脫鈣、脫水、石蠟包埋，然后切片，進行Masson、HE 染色。染色完成后的切片在顯微鏡下觀察、拍照，分析韌帶-骨界面的愈合情況。

1.3.10 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS22.0 和Graphpad 7 軟件對數(shù)據(jù)進行分析，定量數(shù)據(jù)采用x ± s表示，采用t檢驗對組間差異進行比較。P＜0.05提示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 材料表面SEM、EDS檢測及接觸角實驗

如圖1 所示，PET 韌帶浸泡5 min 后，表面出現(xiàn)少量材料附著（B1）；15分鐘后，材料表面出現(xiàn)片狀附著物（C1）；浸泡30 分鐘后表面涂層達到飽和狀態(tài)，韌帶表面形成一層表面略粗糙的薄膜（D1），而對照組PET韌帶表面光滑（A1）。EDS 結(jié)果顯示，對照組表面僅有C、O兩種元素，而處理過的韌帶表面除了C、O，還出現(xiàn)了Ca、Si和Ce元素。經(jīng)Ce-CS凝膠振蕩浸泡處理30分鐘后，涂層材料達到飽和狀態(tài)，PET 表面形成均一、穩(wěn)定的涂層，為有效減少涂層組內(nèi)差異，遂將浸泡處理30分鐘的PET材料作為實驗組進行體內(nèi)外實驗。接觸角實驗結(jié)果顯示：Ce-CS 修飾的材料表面親水性能明顯提升（圖2）。

2.2 細胞增殖檢測結(jié)果

如圖3（A）所示，隨著培養(yǎng)時間延長，各組細胞吸光值（OD）逐漸升高；在細胞培養(yǎng)1 天時，兩組OD 值無明顯差別；培養(yǎng)第3天和第7天時，Ce-CS組OD值明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 ALP活性檢測

如圖3（B）所示，在誘導(dǎo)培養(yǎng)7 天、14 天后，Ce-CS組ALP活性均高于對照組（P＜0.05）。提示Ce-CS涂層能夠促進rBMSCs細胞成骨分化。

2.4 成骨基因表達

如圖4 所示，誘導(dǎo)培養(yǎng)7 天時，OCN 表達水平在兩組間的表達有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），COL-1表達無統(tǒng)計學(xué)差異；誘導(dǎo)培養(yǎng)14 天時，OCN、COL-1 在兩組間的表達均有明顯的差異（P＜0.01，P＜0.05）。

2.5 茜素紅染色

如圖5所示，Ce-CS組中礦化結(jié)節(jié)的數(shù)量明顯多于對照組，與對照組相比，Ce-CS組中的礦化結(jié)節(jié)顆粒更大。定量分析結(jié)果顯示兩組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明了Ce-CS可以有效的促進rBMSCs細胞外礦化結(jié)節(jié)的形成。

圖1 材料表面SEM、EDS檢測結(jié)果

圖2 接觸角實驗結(jié)果

圖3 CCK-8檢測細胞增殖活性結(jié)果（A）和ALP活性測定結(jié)果（B）

圖4 誘導(dǎo)培養(yǎng)7、14天后，OCN、COL-1表達情況

圖5 誘導(dǎo)培養(yǎng)21天后茜素紅染色（A、B）和茜素紅染色定量分析結(jié)果（C）

圖6 股骨Micro-CT掃描及三維重建圖片

圖7 BV/TV、BMD統(tǒng)計分析結(jié)果

2.6 Micro-CT和三維重建分析

CT 掃描圖片（圖6 A1-A4，B1-B4）顯示，本實驗成功建立了關(guān)節(jié)外移植物-骨愈合模型，實驗形成的骨缺損均一、一致，可以對實驗結(jié)果進行分析。三維重建結(jié)果（圖7）表明，右側(cè)骨缺損處新生骨體積高于左側(cè)，骨礦密度（BMD）左側(cè)為0.21 ± 0.02g/cm3，右側(cè)為0.36± 0.04 g/cm3，兩側(cè)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；相對骨體積（BV/TV）左側(cè)為9.04% ± 3.77%，右側(cè)為23.30% ± 4.05%，兩側(cè)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.7 組織學(xué)染色結(jié)果

Masson、HE 染色圖片可見，對照組韌帶與骨界面之間有較多纖維組織形成，沒有明顯的新生骨生成；Ce-CS 組有不同程度的新生骨形成，移植物與骨接線模糊，無明顯分界（圖8）。

圖8 HE染色結(jié)果（A、B）和Masson染色結(jié)果（C、D）

3 討論

ACL 重建是目前治療ACL 斷裂損傷的金標(biāo)準(zhǔn)[10]。ACL 重建的目的是恢復(fù)膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性，使患者恢復(fù)正常的體育運動和活動，降低骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率[8]。理想的移植物需要具備材料容易獲得、與人體骨組織相容性好、生物力學(xué)穩(wěn)定以及術(shù)后斷裂并發(fā)癥少等特點，同時能夠滿足部分病人個體化差異的需求[29]。與自體和同種異體移植物相比，PET 韌帶能夠提供術(shù)后即時的抗拉伸強度，恢復(fù)快，無疾病傳播和免疫排斥的風(fēng)險。LARS 韌帶是我國運動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域目前應(yīng)用最廣泛的人工合成韌帶，其生物力學(xué)性能良好，病人能夠早期恢復(fù)體育運動，在臨床中取得了令人滿意的治療效果[30]。然而，LARS 韌帶主要成分是疏水性的PET 材料，與人體組織的生物相容性差，植入人體后容易誘發(fā)炎癥反應(yīng)，不利于細胞的黏附、增殖和成骨分化，影響移植物與宿主骨之間的愈合[31]。研究發(fā)現(xiàn)，在PET 韌帶表面進行涂層修飾后，移植物的表面疏水性能和生物相容性得到明顯改善[15，32]，移植物在動物體內(nèi)的骨整合性能明顯增強[33]。

硅酸鈣是一種具有良好生物活性的生物陶瓷材料。CS釋放出來的鈣離子和硅離子不僅在表面磷灰石層形成過程中發(fā)揮著重要作用[20]，還可以直接影響成骨細胞代謝，促進骨整合[15]。此外，在CS中摻入金屬元素可以進一步改善其生物活性。金屬鈰具有良好的抗氧化、抗炎和促進血管再生等生物活性。研究發(fā)現(xiàn)，金屬鈰可以通過減少誘生型一氧化氮合酶和細胞內(nèi)超氧岐化酶的生成，清除自由基，從而發(fā)揮抗氧化作用。Chen 等[34]研究表明，即使在較高濃度水平（50 μg/ml）下，Ce也不會引起明顯的炎癥反應(yīng)，這在組織工程領(lǐng)域具有重要意義[35]。Ce 可以促進血管內(nèi)皮細胞的增殖，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)低氧誘導(dǎo)因子-1的表達水平，促進血管的再生[36]，而損傷組織的修復(fù)和再生恰恰高度依賴新生血管的形成。納米氧化鈰制備的生物支架對人BMSCs沒有細胞毒性，能夠增強細胞的成骨分化和膠原蛋白的生成[37]。Li[38]等通過等離子噴涂技術(shù)制備了含氧化鈰的（CeO2）的硅酸鈣涂層，并研究了該涂層對BMSCs和RAW264.7 巨噬細胞系的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該涂層能夠增強細胞的活性，促進BMSCs 細胞的黏附、增殖、ALP 的活性以及礦化結(jié)節(jié)的生成，這些作用隨CeO2含量的增加而增強。

Zhang等[28]在硅酸鈣材料中加入5 mol%、10 mol%的CeO2制備了含CeO2的介孔硅酸鈣生物支架，結(jié)果表明加入CeO2后，材料的降解速率減慢，生物活性明顯提升，10 mol%組支架的各項性能優(yōu)于5 mol%組，但差異沒有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義。前文也提及有文獻報道含CeO2硅酸鈣材料的生物活性隨CeO2含量的增加而增強，因此，本研究制備了含10 mol%鈰的硅酸鈣（Ce-CS）修飾的PET人工韌帶，并通過體外細胞實驗和動物實驗研究了該涂層的生物活性和生物相容性。結(jié)果表明，Ce-CS 能很好地粘附在PET韌帶表面，并在PET韌帶表面形成一層均勻的、表面略粗糙的薄膜，該方法相對簡便、可控。Ce-CS 修飾后的PET 韌帶親水性能明顯提升，更有利于細胞的黏附、增殖，SEM 結(jié)果也證實了這一點。我們通過CCK-8檢測了Ce-CS對細胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時間延長，各組細胞吸光值（OD）逐漸升高，在培養(yǎng)第3天和第7天時，Ce-CS組OD值均高于對照組（P＜0.05），表明Ce-CS 可以促進細胞的增殖。ALP是細胞成骨分化的早期標(biāo)志物。我們的研究結(jié)果表明，Ce-CS 能夠明顯促進骨髓間充質(zhì)干細胞的ALP 活性（P＜0.05）。成骨相關(guān)基因OCN、COL-1在Ce-CS 組表達均高于對照組。此外，本研究還通過茜素紅染色分析了Ce-CS 對細胞外基質(zhì)礦化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，Ce-CS 組細胞外礦化結(jié)節(jié)的數(shù)量更多，礦化結(jié)節(jié)更大，定量分析表明兩組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。上述研究結(jié)果表明，Ce-CS可以促進細胞的黏附、增殖和成骨分化。但是，Ce-CS能否在體內(nèi)促進移植物與骨之間的愈合，我們通過建立兔關(guān)節(jié)外移植物-骨愈合模型加以驗證。Micro-CT結(jié)果顯示，植入Ce-CS 修飾過韌帶的一側(cè)新骨形成量要多于對照側(cè)，兩側(cè)的BMD、BV/TV差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Masson 和HE 染色表明Ce-CS 組有不同程度的新生骨形成，移植物與骨界面之間的間隙變窄，對照組韌帶與骨界面之間有較多纖維組織形成，沒有明顯的新生骨生成，這與Micro-CT結(jié)果一致。

4 結(jié)論

本研究證實含鈰硅酸鈣材料能夠均勻地粘附在PET 韌帶表面，方法簡便、可控；修飾的PET 韌帶能夠促進成骨細胞的黏附、增殖和分化，體內(nèi)實驗驗證了含鈰硅酸鈣具有促進移植物-骨愈合作用，為涂層修飾韌帶在臨床中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。