吳云華, 吳亞婷, 李勇

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430074)

脫落酸(ABA)在植物體內(nèi)具有多種重要生理功能，如促進氣孔關(guān)閉，控制種子萌發(fā)和響應(yīng)外界非生物脅迫等[1]，開發(fā)ABA的檢測方法對研究植物生理功能及信號機制方面具有重要意義. ABA檢測難點在于其在植物內(nèi)含量極低和基質(zhì)復(fù)雜[2]，目前植物激素檢測方法有氣相色譜法、生物測定法、高效液相色譜法、化學(xué)發(fā)光法、質(zhì)譜聯(lián)用法、酶聯(lián)免疫吸附法等[3]， 這些方法存在樣品預(yù)處理復(fù)雜或靈敏度低等問題. 因此需要開發(fā)高靈敏、原位無損檢測方法.

脫落酸的信號傳導(dǎo)是通過脫落酸與其受體識別結(jié)合實現(xiàn). 研究表明：PYL蛋白家族是ABA的受體[4]，水稻有12個OsPYLs同源基因[5]，由于OsPYL2在所有組織中均呈高表達量[6]，故本文選取水稻脫落酸受體 PYL2[Os02g0226801] 為研究對象. mNeonGreen是2013年報道的來自于一種改造文昌魚的單體黃綠色熒光蛋白，在517 nm處有最大發(fā)射[7]，光穩(wěn)定性較以往報道的綠色或黃色熒光蛋白更高，可作融合標簽[8].

本文將黃綠色熒光蛋白mNeonGreen融合在PYL2的C端，用原核表達系統(tǒng)獲得融合蛋白PYL2-mNeonGreen，該融合蛋白能與ABA互作引起mNeonGreen熒光信號的改變. 基于此信號，可實現(xiàn)ABA的熒光檢測.

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

水稻日本晴cDNA,大腸桿菌菌株DH5α,BL21(DE3)，原核表達載體pET-28a，黃綠色熒光蛋白(mNeonGreen)質(zhì)粒均由中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)分析研究組實驗室保存.

內(nèi)切酶NdeI、EcoR I(Takara公司)；金牌MIX(擎科生物)；T4 DNA連接酶(Takara)；S-(+)ABA、蛋白質(zhì)分子量Marker(Thermo)；30%丙烯酰胺/甲叉雙丙酰胺(質(zhì)量比為29∶1)儲液(上海生工)，DNA凝膠回收試劑盒、DNA清潔回收試劑盒、質(zhì)?；厥赵噭┖?Axygen)；DNA分子量Marker和鎳親和純化柱(康維世紀生物)；引物合成及測序(武漢擎科生物技術(shù)).

瓊脂糖及聚丙烯酰胺凝膠電泳儀(DYY-6D，北京六一儀器廠)；熒光光譜儀(F-2500，HITACHI)；細胞破碎儀(JY96-II，杭州川一)；NanoDrop One(Thermo)；水浴鍋(HWS-26型，上海齊欣).

1.2 載體的構(gòu)建

根據(jù)重疊PCR原理，用引物設(shè)計軟件Primer Premier 5.0 設(shè)計特異性引物(見表1)，在PYL2和mNeonGreen蛋白編碼序列之間連入一段十肽(GGGGS)2的柔性鏈做為融合蛋白的linker.

表1 PCR引物序列Tab.1 Primers sequences for PCR

以實驗室水稻日本晴cDNA和含有mNeonGreen編碼序列的質(zhì)粒為模板，用PYL2和Linker-mNeonGreen的上下游引物分別擴增PYL2和mNeonGreen兩個DNA片段，凝膠清潔回收后，以PYL2和mNeonGreenDNA回收產(chǎn)物為模板，用PYL2的上游引物和Linker-mNeonGreen的下游引物進行重疊PCR擴增出PYL2-mNeonGreen融合片段.以mNeonGreen上下游引物，PCR擴增mNeonGreen片段做實驗對照.

將pET-28a質(zhì)粒和擴增得到的目的片段分別用NdeI和EcoR I于37 ℃雙酶切12 h，清潔回收后，4 ℃連接12 h. 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α. 經(jīng)過菌落PCR和雙酶切鑒定陽性菌，測序驗證.

1.3 蛋白表達

將pET-28a空載體質(zhì)粒，pET-28a-mNeonGreen和pET-28a-PYL2-mNeonGreen重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株BL21(DE3)中.從平板中挑取長勢良好的單菌落[9]接種到含有卡納霉素(50 ng/L)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min，12 h培養(yǎng)之后按1∶100的體積比將其轉(zhuǎn)接至150 mL LB培養(yǎng)基(50 ng/L卡納霉素)，37 ℃培養(yǎng)約2 h，待菌液OD值達到0.6，加入終濃度為0.8 mmol/L 的異丙基硫代半乳糖(IPTG)進行誘導(dǎo)，28 ℃，200 r/min，繼續(xù)培養(yǎng)14 h.

1.4 蛋白純化

將誘導(dǎo)后的150 mL mNeonGreen和PYL2-mNeonGreen菌液，放至50 mL離心管中，3000 g于4 ℃離心15 min，倒掉上清收集菌體，沉淀用30 mL 細菌蛋白抽提液(20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，pH 8.0)重懸，加入300 μL溶菌酶(10 mg/mL)和30 μL蛋白酶抑制劑. 上述菌懸液使用細胞破碎儀對細胞進行充分破碎后，10000 g于4 ℃離心15 min，收集上清，用0.22 μm過濾膜過濾，留存?zhèn)溆?

將提前處理好的鎳柱，用ddH20沖洗3次，再用平衡緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，10 mmol/L 咪唑，pH 8.0)平衡2次. 將蛋白表達上清液加入鎳柱中，重復(fù)3次. 先用25倍柱體積洗滌緩液(20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，40 mmol/L 咪唑，pH 8.0)沖洗鎳柱，除去雜蛋白，用考馬斯亮藍檢測是否除干凈. 再用2倍柱體積洗脫緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑，pH 8.0)洗脫目的蛋白. 用考馬斯檢測是否洗脫干凈，純化后的蛋白用PBS透析5 h，每隔2 h換1次透析液，最后分裝至200 μL EP管于-80 ℃冰箱保存.

1.5 蛋白質(zhì)濃度檢測和SDS-PAGE

取透析后的蛋白，用紫外分光光度法A280進行蛋白濃度測定，并對蛋白質(zhì)進行SDS-PAGE分析. 取20 μL蛋白質(zhì)樣品，加入20 μL 2×上樣緩沖液，混勻后于100 ℃加熱15 min進行變性處理. 取10 μL經(jīng)過處理的樣品上樣至SDS-PAGE凝膠中進行電泳分離. 濃縮膠電壓為80 V，分離膠電壓為100 V. 電泳結(jié)束后將凝膠放置平皿中加染色液染色3 h，再加入脫色液脫色至凝膠條帶清晰，并于膠片觀察燈上進行拍照分析.

1.6 蛋白的熒光光譜檢測

用3 mL PBS緩沖液將mNeonGreen和PYL2-mNeonGreen蛋白稀釋成終濃度為30 μmol/L 的溶液[6]，混勻后加入到比色皿中，放入熒光分光光度計，在450 nm波長激發(fā)光下進行掃描，記錄熒光信號I0. 再依次加入1 mmol/L ABA溶液2 μL，掃描記錄熒光光譜Ii. 重復(fù)測定3次，取平均值I，得到熒光差值I=I0-Ii，用Origin軟件作圖分析,

2 結(jié)果及分析

2.1 載體構(gòu)建

用上述設(shè)計引物，可分別擴增PYL2和mNeonGreen兩個DNA片段(見圖1)，切膠回收后，取PYL2和mNeonGreen編碼基因片段各1 μL做模板，PYL2的上游引物和mNeonGreen下游引物各1 μL，同16 μL金牌MIX進行重疊PCR擴增得到PYL2-mNeonGreen的DNA片段(見圖1).

M) DL5000；1)PYL2；2) mNeonGreen；3) PYL2-mNeonGreen圖1 PCR擴增PYL2, mNeonGreen和PYL2-mNeonGreen的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.1 Agarose electrophoresis analysis of PCR products for and PYL2, mNeonGreen and PYL2-mNeonGreen

將pET28a-PYL2-mNeonGreen載體用NdeI和EcoR I進行雙酶切鑒定,酶切產(chǎn)生大小約為1400 bp目的片段(見圖2a)，pET28a-mNeonGreen載體酶切產(chǎn)生大小約為750 bp目的片段(見圖2b)，均與預(yù)期大小相符. 進一步測序驗證后結(jié)果表明，重組載體構(gòu)建成功.

M) DL5000；1) pET-28a空載體；2)重組質(zhì)粒PYL2-mNeonGreen；3) 重組質(zhì)粒pET-28a-mNeonGreen圖2 重組質(zhì)粒pET28a-PYL2-mNeonGreen和pET28a-mNeonGreen雙酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pET-28a-PYL2-mNeonGreen and pET-28a-mNeonGreen by double enzyme digestion

2.2 蛋白質(zhì)的表達與純化

將pET28a-PYL2-mNeonGreen和pET28a-mNeon Green載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21，進行誘導(dǎo)表達和蛋白質(zhì)的分離純化，進行SDS-PAGE檢測(見圖3).

PYL2-mNeonGreen融合蛋白經(jīng)Ni柱親和層析純化和透析后在凝膠中條帶清晰，在49 kDa處附近可明顯看到目的蛋白條帶，與理論預(yù)測49 kDa大小相符. mNeonGreen蛋白在凝膠條帶中清晰且無雜帶，在28 kDa處附近有目的蛋白條帶，與理論預(yù)測28 kDa大小相符. 表明PYL2-mNeonGreen和mNeonGreen蛋白均獲得了表達和純化.

1)蛋白Marker；2) pET-28a空載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21誘導(dǎo)后細胞破碎混合液；3) pET28a-PYL2-mNeonGreen載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21誘導(dǎo)后細胞破碎混合液；4) Ni柱純化后的PYL2-mNeonGreen蛋白表達上清樣品；5) 透析后PYL2-mNeonGreen蛋白純化樣品；6) pET28a-mNeonGreen載體轉(zhuǎn)化大腸菌BL21誘導(dǎo)后細胞破碎混合液；7) Ni柱純化后的mNeonGreen蛋白表達上清樣品；8) 透析后mNeonGreen蛋白純化樣品圖3 重組蛋白表達和純化的SDS-PAGE分析Fig.3 Characterization of the expression and purification of the recombinant proteins by SDS-PAGE

2.3 PYL2-mNeonGreen融合蛋白與脫落酸相互作用的熒光光譜檢測

含有PYL2-mNeonGreen蛋白的PBS溶液，在450 nm 波長激發(fā)光下進行掃描，可產(chǎn)生熒光發(fā)射光譜，該光譜的最大發(fā)射波長約為520 nm，與單體黃綠色熒光蛋白mNeonGreen熒光發(fā)射光譜基本吻合[7](見圖4). 依次加入終濃度為0.67, 1.33, 2.00, 2.67, 3.33 μmol/L 的ABA，其最大發(fā)射峰處的熒光強度不斷降低. 以mNeonGreen蛋白為對照，如圖4b所示，當依次加入等濃度ABA時，mNeonGreen的熒光強度也逐漸降低，但減弱程度明顯小于PYL2-mNeonGreen蛋白熒光降低強度.

圖4 脫落酸加入引起PYL2-mNeonGreen (a) 和mNeonGreen (b) 熒光光譜變化Fig.4 Fluorescence spectra changes ofPYL2- mNeonGreen (a) and mNeonGreen (b) after the addition of abscisic acid

重復(fù)檢測3次取平均值，得到加入溶液濃度和熒光峰值降低程度(I0-Ii)的線性關(guān)系(見圖5). 實驗結(jié)果表明：隨著ABA濃度的不斷增加，融合蛋白PYL2-mNeonGreen的熒光強度不斷降低，其降低程度大于mNeonGreen自身熒光光漂白所引起的熒光強度降低. 扣除mNeonGreen空白對照，得到ABA與融合蛋白互作引起的熒光光譜強度的凈變化值(見圖5內(nèi)插圖)，此信號可用于ABA的定量檢測.

圖5 PYL2-mNeonGreen和mNeonGreen蛋白的熒光峰強度與加入ABA濃度變化的線性關(guān)系Fig.5 The linear relationship between the fluorescence intensity change of PYL2-mNeonGreen or mNeonGreen and the concentration of AB

3 結(jié)語

本文采用重疊PCR技術(shù)，首次將PYL2的C端和綠色熒光蛋白mNeonGreen進行了融合，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-PYL2-mNeonGreen，并對該重組蛋白進行了原核表達與純化，得到較高純度的PYL2-mNeonGreen蛋白，在450 nm波長光激發(fā)下，該融合蛋白在518 nm處具有最大熒光發(fā)射光譜. 該最大發(fā)射峰熒光強度隨ABA濃度的增加而不斷降低，由于PYL2蛋白以同源二聚體存在，在結(jié)合ABA后，PYL2單體-單體相對方位的變化和二聚化界面上氨基酸的重新排布，使PYL2二聚體被削弱[10,11]，引起與其融合的mNeonGreen蛋白結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致其熒光強度減弱. mNeonGreen蛋白穩(wěn)定性較高，但與傳統(tǒng)綠色熒光蛋白一樣具有光漂白性[12]. 脫落酸的加入，使PYL2-mmNeonGreen的熒光強度變化值較大，此信號可于脫落酸的熒光檢測.