基于白色念珠菌體外抑菌效果的復(fù)方苦參洗劑抑菌作用評(píng)價(jià)

程洪杰，李巖*，孫鐵峰

(1.山東省新泰市中醫(yī)醫(yī)院，山東 泰安 271200；2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014)

白色念珠菌是一種機(jī)會(huì)致病真菌，臨床上誘發(fā)的感染性疾病主要由機(jī)體正常菌群失調(diào)，導(dǎo)致其在機(jī)體內(nèi)大量繁殖而引起。隨著唑類(lèi)、多烯類(lèi)抗真菌藥物的廣泛應(yīng)用，使耐藥菌株產(chǎn)生率不斷上升[1-2]。大量研究表明中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中的中藥及復(fù)方制劑在抗真菌方面療效確切、安全性好、耐藥率低[3]，而目前對(duì)中藥類(lèi)制劑抗真菌研究主要集中在復(fù)方對(duì)真菌類(lèi)疾病的臨床療效研究、復(fù)方中單味藥及其提取成分對(duì)真菌抑菌活性和機(jī)理研究[4-7]。以復(fù)方協(xié)同增效的觀點(diǎn)，對(duì)中醫(yī)組方原則下的君、臣、佐、使進(jìn)行評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)研究尚不多見(jiàn)。

本實(shí)驗(yàn)中復(fù)方苦參洗劑(魯藥制字Z09080016)由苦參、地膚子、黃柏等8味中藥復(fù)方組成，是我院研制用于治療念珠菌等真菌感染的中藥復(fù)方制劑，臨床上應(yīng)用于治療女性陰道炎、外陰瘙癢、濕疹和癬等疾病并取得良好療效。該制劑體現(xiàn)了清熱解毒、燥濕止癢的中醫(yī)組方原則，文獻(xiàn)表明方中各藥味均具有一定的抑菌活性，按照中醫(yī)原則組方后，其表現(xiàn)出復(fù)方抑菌效果的增強(qiáng)。但是否與方中君、臣、佐、使藥組的協(xié)同增效有關(guān)，尚待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)以臨床主治的白色念珠菌為代表，通過(guò)體外對(duì)白色念珠菌的抑菌效果，以上述問(wèn)題為導(dǎo)向，對(duì)該制劑的復(fù)方抑菌增效作用進(jìn)行評(píng)價(jià)研究，為該制劑的復(fù)方抑菌增效機(jī)理提供理論支撐，也為制劑的工藝優(yōu)化提供新思路。

1 材料

1.1 菌株與藥材

菌株：由山東省臨床檢驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)菌株為白色念珠菌(C.albicans, ATCC10231)。

中藥材：黃柏Phellodendri Chinensis Cortex、蒲公英Taraxaci Herba、苦參Sophorae Flavescentis Radix、蛇床子Cnidii Fructus、地膚子Kochiae Fructus、花椒Zanthoxyli Fericarpium、白礬Alumen、白鮮皮Dictamni Cortex購(gòu)自上海雷允上中藥飲片廠(chǎng)，經(jīng)山東省中醫(yī)藥研究院林慧彬研究員鑒定為真品，且與實(shí)驗(yàn)中復(fù)方苦參洗劑制劑中使用的中藥材同批次，粉碎過(guò)100目篩備用。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑

RPMI1640培養(yǎng)液(無(wú)抗生素型)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Sabouraud Dextrose Agar，SDA)、沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(Sabouraud Dextrose Broth，SDB)均購(gòu)自上海一基實(shí)業(yè)有限公司；二甲亞砜(Solarbio公司)。

PBS緩沖液：稱(chēng)取Na2HPO42.9 g、KH2PO40.2 g、NaCl 8.0 g、KCl 0.2 g，加無(wú)菌純水至1000 mL，溶解，過(guò)濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

MTT染液：稱(chēng)取MTT(北京索萊寶科技有限公司)粉末0.5 g溶于100 mL PBS溶液中，避光攪拌溶解，過(guò)濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 儀器

CP114電子分析天平(上海奧豪斯儀器有限公司)； STIKCO2恒溫培養(yǎng)箱(上海施都凱儀設(shè)備有限公司)；生物安全柜(蘇凈安泰超凈工作臺(tái)公司)；xMark酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD公司)；ZWY-211C恒溫?fù)u床振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司)；BXM-75VD立式高壓蒸汽滅菌鍋(上海博迅醫(yī)療生物儀器有限公司)；Allegra X-30R高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司)。

2 方法

2.1 供試藥液的制備

單味藥組水提液的制備：按照處方組成及復(fù)方制備方法，取苦參6.0 g、蒲公英6.0 g、黃柏3.0 g、地膚子3.0 g，白礬2.0 g、花椒2.0 g，蛇床子4.0 g、白鮮皮2.4 g分別單獨(dú)置于250 mL圓底燒瓶中，加入100 mL水，稱(chēng)定重量，回流提取3 h后補(bǔ)足重量，分取各單味中藥續(xù)濾液20 mL用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，最終各單藥組濃度相當(dāng)于復(fù)方組中各生藥濃度，分別為苦參0.060 g/mL、蒲公英0.060 g/mL、黃柏0.030 g/mL、地膚子0.030 g/mL、白礬0.020 g/mL、花椒0.020 g/mL、蛇床子0.040 g/mL、白鮮皮0.024 g/mL。121 ℃高壓流通蒸汽滅菌25 min后置于4 ℃冰箱備用。

復(fù)方組水提液的制備：按處方組成全部藥味一起提取，制備方法同上(批號(hào)20180706)，最終制得藥液濃度相當(dāng)于生藥濃度為0.284 g/mL，取續(xù)濾液20 mL用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，121 ℃高壓流通蒸汽滅菌25 min后置于4 ℃冰箱備用。

君藥組水提液的制備：取處方中君藥組成苦參6.0 g、黃柏3.0 g、花椒2.0 g、白礬2.0 g，制備及后續(xù)保存?zhèn)溆梅椒ㄍ希罱K制得藥液濃度相當(dāng)于生藥濃度為0.130 g/mL。

臣藥組水提液的制備：取處方中臣藥組成蒲公英6.0 g、白鮮皮2.4 g，制備及后續(xù)保存?zhèn)溆梅椒ㄍ?，最終制得藥液濃度相當(dāng)于生藥濃度為0.084 g/mL。

佐藥組水提液的制備：取處方中佐藥地膚子3.0 g、蛇床子4.0 g一起置于250 mL圓底燒瓶中，制備及后續(xù)保存?zhèn)溆梅椒ㄍ?，最終制得藥液濃度相當(dāng)于生藥濃度為0.070 g/mL。

2.2 供試菌液的制備

(1)菌種活化：在無(wú)菌條件下用劃線(xiàn)法將冷凍保存在沙氏斜面培養(yǎng)基的標(biāo)準(zhǔn)菌株接入SDA上，37 ℃培養(yǎng)48 h進(jìn)行活化。

(2)供試菌液制備：將上述菌種用標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)挑選單株典型新鮮菌落接入已滅菌的SDB中，37 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h，取出純化培養(yǎng)的菌種無(wú)菌低溫離心(3000 r/min )3 min，棄去上清液，用0.9%無(wú)菌生理鹽水洗脫菌落制成菌懸液，經(jīng)牛鮑氏計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法調(diào)整其菌含量為1×106～5×106cfu ·mL-1，接種時(shí)再用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋1000倍為1×103～5×103cfu ·mL-1備用。

2.3 體外抑菌實(shí)驗(yàn)

單味中藥組：取96孔細(xì)菌培養(yǎng)板，自第1行的第1～8孔分別加100 μL RPMI1640培養(yǎng)液，每行第1孔加200 μL供試中藥水提液，第2孔加100 μL供試中藥水提液，混勻后，自第2孔吸取100 μL混合液加入第3孔混勻，依次向下一孔吸取、混勻，作倍比稀釋?zhuān)恋?孔混勻后，吸取100 μL棄去，吸取2.2項(xiàng)下備用菌液100 μL接種至對(duì)應(yīng)的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的第1～8孔中混勻，即制得濃度為原提取液濃度1/2～1/256的系列含藥培養(yǎng)液，第9孔為陰性對(duì)照(加入100 μL 稀釋為原濃度1/2的RPMI1640培養(yǎng)液及100 μL備用菌液)，第10孔為空白對(duì)照(加入10 μL MTT、100 μL DMSO)。本實(shí)驗(yàn)8種中藥，每種單藥采用上述方法倍比稀釋為8個(gè)濃度梯度，各做3行復(fù)孔，于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)48 h。

復(fù)方組：精密吸取1 mL藥物原液，加入無(wú)菌試管，以同體積RPMI1640培養(yǎng)液稀釋混勻，得到濃度為原液濃度1/2的藥液，同樣方法再操作2次得到濃度為原液濃度1/8的藥液備用。取96孔細(xì)菌培養(yǎng)板，自第1行的第1～5孔分別加100 μL RPMI1640培養(yǎng)基，每行第1 孔加100 μL上述1/8濃度供試中藥水提液，混勻。自第1孔吸取100 μL混合液加入第2孔，依次作倍比稀釋?zhuān)恋?孔混合后，吸取100 μL棄去，吸取2.2項(xiàng)下備用菌液100 μL接種至對(duì)應(yīng)的96孔細(xì)菌培養(yǎng)板第1～5孔中混勻，即制得濃度為原提取液濃度1/32～1/512的系列含藥培養(yǎng)液，第6孔為陰性對(duì)照，第7孔為空白對(duì)照，同時(shí)做3行復(fù)孔，于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)48 h。

君、臣、佐各藥組：稀釋處理方法同單味中藥組，最終制得濃度為原提取液濃度1/2～1/256的系列含藥培養(yǎng)液，第9孔為陰性對(duì)照，第10孔為空白對(duì)照，同時(shí)做3行復(fù)孔。吸取2.2項(xiàng)下備用菌液100 μL接種至對(duì)應(yīng)的96孔細(xì)菌培養(yǎng)板第1～8孔中混勻，于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)48 h。

C′=C0×f，

其中，C′為每孔最終稀釋濃度，C0為原藥液濃度，f為稀釋分?jǐn)?shù)。

MTT法判定ρMIC終點(diǎn)：兩組于培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入10 μL MTT染液后，繼續(xù)培養(yǎng)至結(jié)束，加入100 μL二甲亞砜于搖床震搖20 min，無(wú)菌低溫離心(3000 r /min )10 min，轉(zhuǎn)移顯色上清液于另一孔板，并做好標(biāo)記，使用酶標(biāo)儀測(cè)吸光度A570 nm，并計(jì)算抑菌率，以抑菌率大于等于80%孔的藥液濃度作為ρMIC判定終點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，以3次相同的ρMIC終點(diǎn)為報(bào)告依據(jù)。

抑菌率 = (A陰性對(duì)照-A實(shí)驗(yàn)組) /(A陰性對(duì)照-A空白對(duì)照)×100%。

2.4 體外聯(lián)合抑菌實(shí)驗(yàn)

采用聯(lián)合抑菌指數(shù)(IFIC)判定兩藥聯(lián)合的作用結(jié)果。協(xié)同作用：IFIC≤0. 5；相加作用：0. 52 。

IFIC=(A*/A′)+(B*/B′) ，

其中A*為聯(lián)用時(shí)A藥組ρMIC，A′為單用時(shí)A藥組ρMIC，B*為聯(lián)用時(shí)B藥組ρMIC，B′為單用時(shí)B藥組ρMIC。

3 結(jié)果

3.1 單藥組和復(fù)方組對(duì)白色念珠菌的體外抑菌活性結(jié)果

8味中藥水提液及復(fù)方苦參組對(duì)白色念珠菌的體外抑菌結(jié)果見(jiàn)表1。由結(jié)果可知8味中藥的ρMIC范圍為7.50 ～30.00 mg/mL，其中黃柏、苦參、花椒、白礬4味君藥的ρMIC范圍為5.00～7.50 mg/mL；君、臣、佐各藥組的ρMIC范圍為4.01 ～21.00 mg/mL；復(fù)方組的ρMIC為2.22 mg/mL。

表1 各藥組對(duì)白色念珠菌的體外抑菌活性

3.2 體外聯(lián)合抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4味君藥以及君、臣、佐3個(gè)藥組間進(jìn)行體外聯(lián)合抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2、3。通過(guò)4味君藥聯(lián)合抑菌IFIC發(fā)現(xiàn)：黃柏+苦參、黃柏+白礬、花椒+白礬3組的IFIC≤0.5，作用性質(zhì)為協(xié)同抑菌作用；黃柏+花椒、苦參+花椒、苦參+白礬3組的0.5

表2 黃柏等4味君藥聯(lián)合體外抑菌作用性質(zhì)

表3 君、臣、佐藥組聯(lián)合體外抑菌作用性質(zhì)

4 討論

復(fù)方苦參洗劑處方系由清代《瘍科心得集》中苦參湯化裁而來(lái)，方中苦參、黃柏、明礬大苦大寒，具有清熱燥濕，解毒療瘡，殺蟲(chóng)止癢之功，花椒性辛散、溫通，亦具止痛、止癢之功，4味藥苦寒燥濕為主，辛溫制寒濕為輔，共為方中君藥；蒲公英、白鮮皮苦寒之性稍遜，以祛風(fēng)燥濕，消腫散結(jié)之力輔助君藥，為方中臣藥；蛇床子、地膚子寒中有溫，溫而制寒，以溫陽(yáng)利濕之功為方中佐藥，8藥相合共奏清熱解毒、燥濕止癢之功。研究表明方中8味中藥都有特定抑菌機(jī)制，其中苦參中苦參堿具有抑制白色念珠菌細(xì)胞膜成分麥角固醇合成的作用，抑制其大量繁殖；黃柏中小檗堿可致白色念珠菌分裂周期異常而出現(xiàn)遺傳物質(zhì)丟失；地膚子甲醇萃取液可降低病菌體內(nèi)酶活性[8-9]；蛇床子醇提液能降低真菌Hsp60和Hsp90的表達(dá)，抑制其增殖；白鮮皮提取物可降低白色念珠菌的ALS3、HWP1等相關(guān)基因的表達(dá)，花椒中揮發(fā)油、蒲公英中綠原酸都可破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，白礬溶液可滲入菌體使內(nèi)部蛋白變性，而起到抑菌作用[10-13]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)復(fù)方中8味中藥水提液對(duì)白色念珠菌均有一定的抑菌效果，其中花椒、白礬、苦參、黃柏4味君藥對(duì)白色念珠菌抑菌效果較好，君藥組的抑菌活性強(qiáng)于各單藥組、臣藥組和佐藥組，復(fù)方組的抑菌效果最好；通過(guò)4味君藥進(jìn)行體外聯(lián)合抑菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黃柏+苦參、黃柏+白礬、花椒+白礬的聯(lián)合抑菌作用性質(zhì)為協(xié)同抑菌，黃柏+花椒、苦參+花椒、苦參+白礬的聯(lián)合抑菌作用性質(zhì)為相加抑菌；通過(guò)君、臣、佐3個(gè)藥組間聯(lián)合抑菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)君藥組+臣藥組的聯(lián)合抑菌作用性質(zhì)為協(xié)同抑菌，君藥組+佐藥組、臣藥組+佐藥組的聯(lián)合抑菌作用性質(zhì)為相加抑菌。綜上所述，復(fù)方組的聯(lián)合抑菌效果明顯強(qiáng)于單藥組和君、臣、佐3個(gè)藥組的抑菌效果，從4味君藥聯(lián)合抑菌結(jié)果分析，黃柏與苦參、白礬以及花椒與白礬的協(xié)同抑菌作用，苦參與花椒、白礬以及黃柏與花椒的相加抑菌作用都參與了君藥組聯(lián)合抑菌效果的增強(qiáng)，黃柏、苦參、花椒、白礬4味君藥在復(fù)方整體的抑菌效果中作用較大，這體現(xiàn)了中醫(yī)組方君藥發(fā)揮主要治療作用的原則。君、臣、佐各藥組以抑菌效果由大到小排序?yàn)榫幗M、佐藥組、臣藥組，其中君藥組+臣藥組的協(xié)同抑菌作用體現(xiàn)了中醫(yī)組方臣藥輔助君藥加強(qiáng)治療作用的原則，而君藥組+佐藥組、臣藥組+佐藥組的相加抑菌作用體現(xiàn)了中醫(yī)組方佐助藥協(xié)助君、臣藥加強(qiáng)治療作用的原則。通過(guò)上述各藥組協(xié)同和相加抑菌作用相互配合，使得復(fù)方苦參洗劑表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑菌效果。

該中藥復(fù)方在遣藥組方時(shí)既遵循中醫(yī)藥理論原則，又符合現(xiàn)代多效、聯(lián)合、協(xié)同的抑菌藥物應(yīng)用規(guī)律，本實(shí)驗(yàn)中復(fù)方苦參洗劑所含8味中藥均具有不同的抑菌活性，通過(guò)對(duì)具有不同抑菌譜和抑菌機(jī)制的中藥復(fù)方運(yùn)用，提高了制劑的抑菌效果，作為傳統(tǒng)制劑，還可根據(jù)本實(shí)驗(yàn)中復(fù)方抑菌協(xié)同增效作用的相關(guān)研究，優(yōu)化黃柏、苦參、花椒、白礬4味君藥的制備工藝，適當(dāng)調(diào)整君藥組、臣藥組和佐藥組的投料配比，使其更好地發(fā)揮中藥抗菌作用。