鞠靜，彭玲玲，潘宇政*，譚人千，潘茂華，韋進(jìn)新

(1. 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院, 南寧 530021； 2. 廣西上林縣人民醫(yī)院，南寧 530500；3. 南寧市第四人民醫(yī)院，南寧 530021)

氣管切開術(shù)是臨床搶救呼吸困難、病情危重病人采取的必要手段。但術(shù)后極易導(dǎo)致肺部炎癥[1-2]。有效的預(yù)防及治療氣管切開術(shù)后肺部感染是臨床急需解決的難題。目前抗生素治療是針對(duì)肺部炎癥的首選方案，但長期使用抗生素引起的不良反應(yīng)和耐藥性，使醫(yī)藥界致力于尋求更合理的替代治療方案，從而減少抗生素的使用。

本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)[3]，給予氣管切開插管留置大鼠補(bǔ)腎陽中藥淫羊藿水提取物后，對(duì)大鼠肺部感染有一定的療效，免疫功能有所提高。目前研究認(rèn)為，中藥淫羊藿發(fā)揮作用的主要活性成分是以淫羊藿苷為代表的黃酮苷類化合物及其體內(nèi)代謝產(chǎn)物[4]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明淫羊藿苷具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、改善心腦血管、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等多重藥理學(xué)作用[5-7]，是近年來國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)中藥單體成分之一。隨著淫羊藿苷的藥理作用研究的不斷深入臨床上療效也顯示出巨大的優(yōu)勢(shì)。

本實(shí)驗(yàn)通過建立氣管切開大鼠動(dòng)物模型,探討淫羊藿苷及其代謝產(chǎn)物寶藿苷I對(duì)氣管切開術(shù)后大鼠肺組織損傷的作用并研究其可能的炎癥反應(yīng)機(jī)制，為中藥指導(dǎo)治療臨床危急重癥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠72只，體重(250 ± 20)g，購于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK (桂) 2014-0002】。分籠飼養(yǎng)在環(huán)境溫度為(20 ± 2)℃，相對(duì)濕度40%～60%的廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房【SYXK (桂) 2014-0002】，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。自由進(jìn)水，普通飼料喂養(yǎng)。所有的實(shí)驗(yàn)過程均經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理倫理委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行【倫理審批號(hào)：2014-KY-148】。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)用主要試劑

淫羊藿苷(購于上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：T09N6B5664，HPLC≥98%)，寶藿苷I(購于上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：R11M8F 31212，HPLC≥98%)，大鼠IL-6 ELISA試劑盒(Cusabio，批號(hào)：S03019750)，大鼠TNF-αELISA試劑盒(Cusabio，批號(hào)：S14019751)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

將72只雄性SD大鼠進(jìn)行1周的適應(yīng)性喂養(yǎng)，隨機(jī)分成4組(n=18)：正常組(A)、模型非用藥組(B)、模型+寶藿苷I組(C)、模型+淫羊藿苷組(D)。

1.2.2 模型制作

大鼠實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。B、C、D三組大鼠造模方法參照經(jīng)典文獻(xiàn)[8]實(shí)驗(yàn)性氣管切開肺部感染模型進(jìn)行。如1導(dǎo)管內(nèi)有呼吸所致蒸氣貼壁；2將刀柄置于外口，刀柄上出現(xiàn)氣霧；3將棉花或者發(fā)絲置于兩組導(dǎo)管外口，可見其隨呼吸飄動(dòng)。證實(shí)導(dǎo)管在氣管內(nèi)；術(shù)后大鼠清醒視作動(dòng)物模型制作成功。

1.2.3 給藥干預(yù)

模型制作成功后 6 h 進(jìn)行給藥干預(yù)。C 組給予寶藿苷I 4 mg/(kg·d)、D 組給予淫羊藿苷 30 mg/(kg·d)灌胃，實(shí)驗(yàn)用藥均參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[9]按人和大鼠體重?fù)Q算得出，A、B 組給予等量0.9% 生理鹽水，每日1 次。大鼠處理24、72、168 h后，各組分別取材6只大鼠。用戊巴比妥鈉溶液45 mg/kg腹腔注射麻醉后，剖開胸腔, 用止血鉗夾閉右主支氣管，用4℃預(yù)冷滅菌0.9% 生理鹽水3 mL反復(fù)灌洗左肺部3次，共回收肺泡灌洗液約6 mL(用于測(cè)定TNF-α及IL-6含量)。剪取右肺組織放入4%多聚甲醛溶液固定(HE染色觀察組織病理學(xué))。

1.3 主要觀察指標(biāo)

1.3.1 肺組織蘇木精-伊紅染色

取左肺組織用冰凍生理鹽水清洗后，放入4%多聚甲醛溶液固定12 h，常規(guī)脫水處理石蠟包埋，切片制成5 μm切片，經(jīng)脫蠟按照蘇木精-伊紅染色步驟染色后于光學(xué)顯微鏡(Olympus，日本)下觀察肺組織的病理形態(tài)學(xué)改變。并參考李麗瑋等[10]改良版肺組織病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行肺組織病理評(píng)分。

1.3.2 肺泡灌洗液TNF-α及IL-6檢測(cè)

將收集的肺泡灌洗液離心取上清嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作，并使用酶標(biāo)儀(Thermo Multiskan，美國)于450 nm檢測(cè)吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線用專業(yè)軟件CurveExpert 分別計(jì)算每個(gè)樣本中TNF-α、IL-6的質(zhì)量濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠氣管切開模型成功后的表現(xiàn)

術(shù)后大鼠清醒，一般活動(dòng)情況、精神狀態(tài)良好，偶見有大鼠出現(xiàn)痰鳴的癥狀。8 h后逐漸恢復(fù)飲水，隨后慢慢開始少量自主進(jìn)食。

2.2 肺組織病理評(píng)分

B組大鼠氣管切開插管留置后三個(gè)時(shí)段肺組織病理評(píng)分均明顯高于A組正常大鼠，差異有顯著性(P=0.011、0.011、0.009)，且隨著時(shí)間延長，B組內(nèi)逐漸升高。C、D兩組分別用寶藿苷I和淫羊藿苷處理后，與B組相比：C組在168 h(5.833 ± 1.184)明顯低于B組(10.750 ± 2.217)，差異有顯著性(P=0.036)，D組在72 h(5.750 ± 1.258)、168 h(3.260 ± 0.527)均明顯低于B組(9.680 ± 1.044、10.750 ± 2.217)，差異有顯著性(P=0.009、0.013)。D組在24 h(5.500 ± 1.049)、168 h(3.260 ± 0.527)均明顯低于C組(8.460 ± 1.361、5.833 ± 1.184)，差異有顯著性(P=0.013、0.005)。C、D兩組組內(nèi)各時(shí)段相比，均在168 h明顯低于24 h，差異有顯著性(P=0.027、0.006)。這些結(jié)果提示：寶藿苷I和淫羊藿苷均可改善肺組織損傷程度，且淫羊藿苷效果更佳。結(jié)果見圖1。

注：組間與A組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。與B組比較，#P< 0.05，##P< 0.01。與C組比較，△P< 0.05，△△P< 0.01。組內(nèi)與24 h比較，□P< 0.05，□□P< 0.01。與72 h比較，P< 0.05，P< 0.01.(下圖同)圖1 大鼠肺組織病理學(xué)評(píng)分Note.*P< 0.05,**P< 0.01, vs group A.#P< 0.05, ##P< 0.01, vs group B.△P< 0.05,△△P< 0.01, vs group C.□P< 0.05,□□P< 0.01, vs 24 h.P < 0.05，P < 0.01, vs 72 h.(The same in the following figures)Figure 1 Histopathological scores of lung tissues in the rats

2.3 各組大鼠肺組織病理變化

如圖2所示，A組正常大鼠：肺泡大小均勻，結(jié)構(gòu)完整，肺泡上皮細(xì)胞形態(tài)正常，肺泡間隔未見增寬，微血管未見充血和淤血，肺間質(zhì)間隙未見出血、水腫及炎細(xì)胞浸潤。B組氣管切開模型大鼠：肺泡間隔明顯增寬，肺泡壁損傷、斷裂，肺泡融合，微血管擴(kuò)張、充血，部分肺泡腔內(nèi)可見大量紅細(xì)胞及炎癥細(xì)胞，間質(zhì)間隙充滿中性粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤，且肺間隔明顯增厚，支氣管管腔及周圍炎性細(xì)胞浸潤。隨著時(shí)間延長肺組織損傷程度逐漸加重。C組寶藿苷I干預(yù)氣管切開模型大鼠：肺組織損傷程度較B組輕，隨著時(shí)間延長，肺泡結(jié)構(gòu)逐漸完整，間隔變窄，肺泡腔及支氣管周圍炎性細(xì)胞逐漸減少。D組淫羊藿苷干預(yù)氣管切開模型大鼠：損傷程度輕于B、C組，隨著時(shí)間延長，肺組織結(jié)構(gòu)越趨于正常組水平。

圖2 各組大鼠肺組織病理變化(HE染色, ×100)Figure 2 Pathological changes of lung tissues in the rats of each group (HE staining, × 100)

2.4 各組大鼠各時(shí)點(diǎn)肺泡灌洗液IL-6、TNF-α含量

如圖3、4所示，B組大鼠氣管切開插管后肺泡灌洗液IL-6和TNF-α含量在三個(gè)時(shí)段均明顯高于A組且差異有顯著性(P=0.003、0.000、0.003；0.004、0.017、0.006)。C、D兩組分別用寶藿苷I和淫羊藿苷干預(yù)后， IL-6、TNF-α含量在72、168 h均明顯低于B組，差異有顯著性(P< 0.05)；且C、D組組內(nèi)IL-6和TNF-α含量在72、168 h均明顯低于24 h，差異有顯著性(P< 0.05)；D組與C組相比，IL-6含量差異無顯著性(P> 0.05)。D組TNF-α在72、168 h均明顯低于C組，差異有顯著性(P< 0.05)。這些結(jié)果提示：寶藿苷I和淫羊藿苷均可抑制氣管切開插管大鼠肺泡灌洗液IL-6、TNF-α表達(dá)，且淫羊藿苷效果更佳。

圖3 大鼠肺泡灌洗液中IL-6含量Figure 3 IL-6 content in the rat alveolar lavage fluid

圖4 大鼠肺泡灌洗液TNF-α含量Figure 4 TNF-α content in the rat alveolar lavage fluids

3 討論

氣管切開術(shù)，中醫(yī)理論認(rèn)為，其屬于“金破不鳴”，肺主宣發(fā)肅降，腎主納氣，肺腎二臟功能正常，從而保證體內(nèi)外氣體的正常交換，“補(bǔ)肺益腎法”在肺系疾病的運(yùn)用中較為常見，且療效顯著[11]。Wang等[12]研究的補(bǔ)腎益氣方(主要由淫羊藿組成)，能減少COPD患者急性加重次數(shù)，改善肺功能，提高機(jī)體抗炎能力，重塑致炎/抑炎調(diào)控機(jī)制的平衡。Qiao 等[13]用淫羊藿苷干預(yù)小鼠哮喘模型，結(jié)果降低了小鼠氣道高反應(yīng)同時(shí)減輕氣道炎癥程度。本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)淫羊藿水提取物對(duì)氣管切開大鼠免疫功能有改善的作用[3]。本實(shí)驗(yàn)在動(dòng)物氣管切開實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ突A(chǔ)上，研究淫羊藿苷及其代謝產(chǎn)物寶藿苷I對(duì)氣管切開后早期肺部炎癥的影響，以期獲得改善氣管切開后早期肺部炎癥的有效中藥單體。

IL-6是一種由淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，具有多種生物學(xué)功能，大量研究表明細(xì)胞炎性因子IL-6能夠作為炎癥早期因子，促進(jìn)其他炎性因子的分泌，放大炎性反應(yīng)[14]；TNF-α是由單核巨噬細(xì)胞分泌的具有防御和致病雙重作用的細(xì)胞因子，在機(jī)體正常狀態(tài)下水平較低，而在機(jī)體處于炎性狀態(tài)時(shí)明顯升高[15]， TNF-α 可通過增強(qiáng)中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的功能，刺激其產(chǎn)生超氧化物，釋放溶酶體酶，介導(dǎo)其他炎癥因子和細(xì)胞因子表達(dá)，進(jìn)一步加重炎性反應(yīng)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)纖維母細(xì)胞分泌大量膠原蛋白，促進(jìn)肺纖維化的發(fā)展[16]。洪原城等[17]臨床研究發(fā)現(xiàn)急性肺損傷患者IL-6、TNF-α水平均顯著高于對(duì)照組，且隨著損傷程度的家中呈升高趨勢(shì)，同時(shí)對(duì)患者預(yù)后分析顯示，死亡組患者IL-6、TNF-α水平與存活組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果提示IL-6和TNF-α水平可作為評(píng)價(jià)病情進(jìn)展及預(yù)后的可靠指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，經(jīng)氣管切開插管造模后，大鼠肺泡灌洗液IL-6、TNF-α含量明顯升高，三個(gè)時(shí)間段均明顯高于正常組水平(P< 0.05)，且隨著時(shí)間延長逐漸升高。這與魏珍星等[18]臨床研究發(fā)現(xiàn)耳鼻喉術(shù)后患者并發(fā)肺部感染，炎癥因子在體內(nèi)進(jìn)行性升高趨勢(shì)一致。用寶藿苷I和淫羊藿苷干預(yù)后，IL-6、TNF-α含量在72、168 h明顯低于模型對(duì)照組水平(P< 0.05)；且藥物干預(yù)組組內(nèi)IL-6和TNF-α含量在72、168 h明顯低于24 h(P< 0.05)；兩種藥物干預(yù)比較，IL-6含量無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P> 0.05)，但淫羊藿苷組TNF-α在168 h明顯低于寶藿苷I(P< 0.05)。同時(shí)，肺組織病理結(jié)果提示，寶藿苷I組在168 h肺損傷程度明顯輕于模型組，淫羊藿苷組在24、168 h肺損傷程度均明顯輕于模型組及寶藿苷I組。

到目前為止，淫羊藿中已被分離鑒定的單體化合物有260余種，主要為黃酮類化合物，其中以淫羊藿苷含量最高[19]。淫羊藿苷又可經(jīng)腸道菌群代謝為寶藿苷I、淫羊藿素等。劉蕊等[20]對(duì)淫羊藿苷在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿素在調(diào)節(jié)脂肪肝過程中發(fā)揮主要作用。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷改善氣管切開大鼠肺部炎癥及組織損傷程度優(yōu)于寶藿苷I。其機(jī)制可能與二者藥代動(dòng)力學(xué)特性不同[21]有關(guān)，亦可能是淫羊藿苷經(jīng)代謝后除寶藿苷I之外的代謝產(chǎn)物發(fā)揮主要作用。有關(guān)淫羊藿苷對(duì)氣管切開后肺部炎癥發(fā)揮藥理作用的具體有效成分及機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究通過建立大鼠氣管切開術(shù)模型，證實(shí)淫羊藿苷及其代謝產(chǎn)物寶藿苷I對(duì)氣管切開術(shù)后早期肺部炎癥有一定療效，且淫羊藿苷療效優(yōu)于寶藿苷I。其機(jī)制與抑制肺泡灌洗液炎癥因子IL-6、TNF-α的表達(dá)，同時(shí)減輕肺組織損傷有關(guān)。為中藥指導(dǎo)治療氣管切開術(shù)后肺部炎癥提供有力實(shí)驗(yàn)依據(jù)。