涂國(guó)章 張顯強(qiáng)

（1 貴州警察學(xué)院刑事技術(shù)系 貴州 貴陽(yáng) 550005；

2 貴州省道路交通事故鑒定工程技術(shù)研究中心 貴州 貴陽(yáng) 550005）

1 引言

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人民生活質(zhì)量的普遍提高，機(jī)動(dòng)車尤其是家用汽車已經(jīng)走進(jìn)千家萬(wàn)戶。與此同時(shí)，隨著機(jī)動(dòng)車保有量的增加，由機(jī)動(dòng)車引發(fā)的交通事故也不斷增多。國(guó)家統(tǒng)計(jì)局資料顯示；2017年底，我國(guó)機(jī)動(dòng)車保有量為3.1億輛，其中汽車2.17億輛，相比2016年增加11.85%。2016全年共發(fā)生道路交通事故數(shù)21.2846萬(wàn)起，機(jī)動(dòng)車交通事故數(shù)19.2585萬(wàn)起，由酒駕引發(fā)的0.48萬(wàn)起，約占2.5%，相比2011前的10%降低約7.5個(gè)百分點(diǎn)。另?yè)?jù)公安部交管局統(tǒng)計(jì)，酒駕是引起交通事故的主要因素之一。酒精的刺激作用使人興奮，但酒精在人體血液內(nèi)達(dá)到一定濃度時(shí)，人對(duì)外界的反應(yīng)能力及控制能力就會(huì)下降，處理緊急情況的能力也隨之降低。當(dāng)駕駛者血液中酒精含量達(dá)80mg/100mL時(shí)，發(fā)生交通事故的幾率是血液中不含酒精時(shí)的2.5倍；達(dá)到100mg/100mL時(shí)，發(fā)生交通事故的幾率是血液中不含酒精時(shí)的4.7倍[1-2]。雖然2011年5月醉駕入刑實(shí)施后，酒后駕駛交通事故數(shù)呈下降趨勢(shì)，但總體數(shù)值居高不下，國(guó)內(nèi)酒后駕駛現(xiàn)象仍然較為嚴(yán)重。

目前法律法規(guī)對(duì)酒駕有嚴(yán)格的限制，但對(duì)酒駕的認(rèn)定主要以血液乙醇含量高低為依據(jù)。依法治國(guó)背景下，對(duì)血液乙醇含量檢測(cè)條件的把握、檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、受檢人員飲酒程度進(jìn)行公正的認(rèn)定顯得尤為重要。然而對(duì)于血液乙醇含量準(zhǔn)確測(cè)試的影響因素較多，如血儲(chǔ)容器、保存溫度、保存時(shí)間等，在以往研究中，馬棟等對(duì)血液中乙醇保存穩(wěn)定性進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)溫度、血儲(chǔ)容器中空氣所占比例、質(zhì)量濃度、防腐劑4個(gè)因素中溫度對(duì)血液乙醇穩(wěn)定性影響最大[3]。以往的研究有探討抗凝劑的有無(wú)對(duì)血液乙醇檢測(cè)結(jié)果的影響[4]，不同抗凝劑對(duì)血液乙醇檢測(cè)結(jié)果的影響等[5-6]，但未明確最佳血儲(chǔ)容器，其結(jié)果不能有效指導(dǎo)實(shí)踐。酒駕血樣保存溫度控制在什么范圍至今尚無(wú)定論，目前國(guó)內(nèi)這方面研究大多探討設(shè)定冰箱4～8℃、室溫25℃儲(chǔ)存條件時(shí)的影響，對(duì)于4℃以下和30℃以上儲(chǔ)存條件的探討很少涉及[7-8]，而實(shí)踐中保存血樣溫度隨意性大，有在常溫保存的、有在4～8℃冰箱保存的、有在-20℃冰柜保存的，最適保存溫度尚待確立。在保存時(shí)間方面，血樣采集后究竟保存多長(zhǎng)時(shí)間對(duì)測(cè)試結(jié)果沒(méi)影響，國(guó)內(nèi)對(duì)這方面的探討很少，有提到在4h內(nèi)盡快測(cè)定的，有籠統(tǒng)地說(shuō)及時(shí)測(cè)定的[8-9]。雖然上述文獻(xiàn)對(duì)血儲(chǔ)容器、保存溫度、保存時(shí)間等影響血液乙醇含量的研究都有涉及，但均并未明確最佳條件。由于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中沒(méi)有相關(guān)規(guī)定，缺乏統(tǒng)一規(guī)范，實(shí)踐中對(duì)于血儲(chǔ)容器、保存溫度、保存時(shí)間的使用和選擇上混用現(xiàn)象較普遍，隨意性大，這勢(shì)必會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果失準(zhǔn)，影響交管部門(mén)對(duì)酒后駕駛的判定。因此，研究血液乙醇含量穩(wěn)定性與血儲(chǔ)容器、保存溫度、保存時(shí)間的關(guān)系，探討最佳血儲(chǔ)容器、最佳保存溫度和有效保存時(shí)間極具必要性，對(duì)于協(xié)助執(zhí)法人更為科學(xué)地采集血樣、合理保存血樣、把握有效的分析檢驗(yàn)時(shí)間，取得可靠的檢測(cè)結(jié)果具有重要的價(jià)值意義。

2 材料與方法

2.1 樣本來(lái)源

選取健康成年男性30名，飲酒后30min后至檢測(cè)中心抽取靜脈鮮血2mL各10管，血樣分別儲(chǔ)存于EDTA-k2管、肝素鈉管、枸櫞酸鈉1:9管（檸檬酸鈉1:9）、氟化鈉-草酸鉀管、枸櫞酸鈉1:4管（檸檬酸鈉1:4）中，立即檢測(cè)各管的血液乙醇含量，選擇其中乙醇濃度≥20mg/100mL且數(shù)值接近的血樣為研究樣本，每種采血管選擇10支，共50支并在冰箱（4～8℃）下冷藏保存，5種管依次以A、B、C、D、E標(biāo)記，每種管的10支管分別以1-10編號(hào)進(jìn)行初篩。在此基礎(chǔ)上，選擇血液乙醇含量檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性較好的真空抗凝管，各取10支乙醇濃度≥20mg/100mL且數(shù)值接近的血樣在-20℃下冰柜保存進(jìn)行第二次篩選。選擇血液乙醇檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性最好的管50支，采取乙醇濃度≥ 20mg/100mL且數(shù)值接近的血樣，其中40支管分4組，每組10支分別在-20℃、4～8℃、25℃、35～42℃這4個(gè)溫度下儲(chǔ)存（分別依次標(biāo)記為Z、Y、X、W，各種抗凝管的10支管依然分別按1～10號(hào)編號(hào)），剩余的10支管在-20℃下溫度儲(chǔ)存180 d檢測(cè)保存時(shí)效性。

2.2 儀器分析條件

色譜儀型號(hào)：島津GC-2010plus。頂空儀型號(hào)：島津HS-20。色譜柱1：Rtx-BAC1，30×0.32毛細(xì)柱。色譜柱2：Rtx-BAC2，30×0.32毛細(xì)柱。柱溫：40℃。進(jìn)樣口溫度：150℃，柱流量5mL/min，吹掃流量3mL/min，分流比6.4。檢測(cè)器FID1和FID2：溫度250℃。頂空進(jìn)樣：恒溫爐65℃，樣品流路溫度105℃，傳輸線溫度110℃，樣品瓶恒溫時(shí)間10min，加壓時(shí)間0.3min，加壓平衡時(shí)間0.3min，導(dǎo)入時(shí)間0.8min，導(dǎo)入平衡時(shí)間0.4min，進(jìn)樣時(shí)間0.5min ，進(jìn)樣針沖洗時(shí)間0.4min。

2.3 血儲(chǔ)容器及試劑

血儲(chǔ)容器枸櫞酸鈉1:9管（檸檬酸鈉1:9）、EDTA-k2管、肝素鈉管、枸櫞酸鈉1:4管（檸檬酸鈉1:4）、氟化鈉-草酸鉀管全部選用江西贛達(dá)醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)的采血管。乙醇標(biāo)準(zhǔn)液濃度為100mg/100mL，乙醇標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)自司法部司法鑒定技術(shù)研究所；叔丁醇標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)自上海安譜科學(xué)儀器有限公司，內(nèi)標(biāo)液濃度40μg/mL。

2.4 樣本的測(cè)定

測(cè)定按照公共安全行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《生物樣品血液、尿液中乙醇、甲醇、正丙醇、乙醛、丙酮、異丙醇和正丁醇的頂空氣相色譜檢驗(yàn)方法》（GA/T1073-2013）進(jìn)行。采用內(nèi)標(biāo)曲線法定量，以叔丁醇為內(nèi)標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=0.0574386 X -0.0266151，Y為乙醇與叔丁醇的峰面積比值， X為乙醇工作溶液濃度（mg/100mL）。定量數(shù)據(jù)為FID2的數(shù)據(jù)，并對(duì)同一樣品進(jìn)行平行試驗(yàn)，結(jié)果取均值，雙樣相差不得超過(guò)5%。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用Duncan氏新復(fù)極差法比較不同處理間的顯著差異性，采用Excel 2013和SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并采用單因素方差分析和重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析。檢測(cè)水準(zhǔn)α≈0.05[10-11]。

3 結(jié)果與分析

3.1 血儲(chǔ)容器的篩選

3.1.1 4～8℃冰箱冷藏下5種血儲(chǔ)容器血液乙醇含量穩(wěn)定性隨時(shí)間的變化

如表1結(jié)果顯示；5種管的血液乙醇含量檢測(cè)結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5種真空抗凝采血管中3d內(nèi)血液乙醇含量基本沒(méi)有變化，7d時(shí)前4種管基本無(wú)變化，與第5種管有顯著性差異（P〈0.05）；14～28d內(nèi)前3種管間無(wú)顯著性差異，后2種管與前3種管之間有顯著性差異（P〈0.05）。5種真空抗凝采血管作為血儲(chǔ)容器時(shí)血液乙醇含量均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。EDTA-k2管、枸櫞酸鈉1:9管（檸檬酸鈉1:9）、肝素鈉管在14d內(nèi)測(cè)試乙醇含量無(wú)顯著性變化，14d后乙醇含量發(fā)生顯著下降。氟化鈉-草酸鉀管在7d內(nèi)測(cè)試乙醇含量結(jié)果穩(wěn)定，7d后測(cè)試乙醇含量顯著降低。而枸櫞酸鈉1:4管（檸檬酸鈉1:4）在3d內(nèi)測(cè)試乙醇含量無(wú)顯著性變化，3d后測(cè)試乙醇含量明顯降低。可見(jiàn)4～8℃冰箱冷藏下5種管中EDTA-k2管、枸櫞酸鈉1:9管（檸檬酸鈉1:9）、肝素鈉管這3種真空抗凝管為較佳血儲(chǔ)容器。

表1 4～8℃下5種采血管中血液乙醇含量變化（mg/100mL）

3.1.2 -20℃下3種血儲(chǔ)容器血液乙醇含量穩(wěn)定性隨時(shí)間的變化

在-20℃下條件下，以4～8℃冰箱冷藏下血液乙醇含量穩(wěn)定性較好的3種真空抗凝管作為血儲(chǔ)容器進(jìn)一步篩選，3種管的血液乙醇含量檢測(cè)結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。35d內(nèi)3種真空抗凝管之間無(wú)顯著性差異，42d后3種真空抗凝管之間均存在顯著性差異（P〈0.05）。3種管的血液乙醇含量隨儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，其中肝素鈉管和枸櫞酸鈉1:9管在35d內(nèi)血液乙醇含量較穩(wěn)定，35d后明顯降低，而EDTA-k2管在49d內(nèi)血液乙醇含量穩(wěn)定，無(wú)顯著性變化?？梢?jiàn)，-20℃冰箱冷藏時(shí)以EDTA-k2管為最佳血儲(chǔ)容器，如表2所示。

表2 -20℃下3種采血管中血液乙醇含量變化（mg/100mL）

3.2 不同保存溫度下血液乙醇含量穩(wěn)定性的比較

不同保存溫度下血液乙醇含量檢測(cè)結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如表3和圖1所示，在3d內(nèi)不同溫度保存下血液乙醇含量結(jié)果穩(wěn)定，無(wú)顯著性變化；7～14d-20℃和4～8℃無(wú)顯著性差異（P〉0.05），但與25℃和35～42℃具有顯著性差異（P〈0.05）。4個(gè)溫度保存下血液乙醇含量均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。-20℃溫度下存儲(chǔ)的血液乙醇含量在28d內(nèi)結(jié)果比較穩(wěn)定；4～8℃溫度下存儲(chǔ)的血液乙醇含量在14d內(nèi)基本穩(wěn)定，14d后顯著下降（P〈0.05）； 25℃和35～42℃溫度下存儲(chǔ)的血液乙醇含量在3 d內(nèi)基本穩(wěn)定，3d后顯著下降?？梢?jiàn)，-20℃溫度保存條件是血液乙醇含量測(cè)試保存血樣的最佳溫度條件。

3.3 -20℃下不同保存時(shí)間的血液乙醇含量及模型篩選

表3 不同保存溫度下血液乙醇含量的變化（mg/100mL）

圖1 不同保存溫度下血液乙醇含量的變化趨勢(shì)

表4 不同保存時(shí)間下血液乙醇含量的變化（mg/100mL）

從表4和圖2可知，血液乙醇含量隨保存時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。通過(guò)單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，在90d內(nèi)血液乙醇含量變化不大，90d后顯著下降。可見(jiàn)酒駕血液樣品的保存時(shí)效為90d。

圖2 不同保存時(shí)間下血液乙醇含量變化動(dòng)態(tài)

再利用Duncan氏新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)法分析，發(fā)現(xiàn)在-20℃冰箱冷藏血液中乙醇含量變化最小。所以利用-20℃保存溫度下血液乙醇含量隨保存時(shí)間變化曲線做回歸分析，得到-20℃保存溫度下血液乙醇含量的回歸方程，線性、二次、三次、復(fù)合、增長(zhǎng)、指數(shù)函數(shù)6個(gè)的擬合優(yōu)度都比較高，系數(shù)均滿足顯著性檢驗(yàn)。但從數(shù)據(jù)趨勢(shì)可知，三次函數(shù)更加符合實(shí)際情況，如表5和圖3所示，乙醇含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。保存時(shí)間越長(zhǎng)的血液，乙醇含量降低速度越快，這表明當(dāng)保存時(shí)間延長(zhǎng)至某一時(shí)間時(shí)測(cè)定血液乙醇含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，90d為酒駕血液有效保存時(shí)間。

表5 -20℃保存溫度下血液乙醇含量（y）隨保存時(shí)間（x）變化曲線估計(jì)

圖3 -20℃保存溫度下血液乙醇含量的三次函數(shù)回歸方程

4 討論

針對(duì)國(guó)內(nèi)以往對(duì)血儲(chǔ)容器、保存溫度、保存時(shí)間等影響血液乙醇含量的研究并未明確最佳條件的現(xiàn)狀，本研究首先通過(guò)對(duì)現(xiàn)行的9種真空采血管中5種抗凝管先后在4～8℃和-20℃保存下進(jìn)行選擇性探究，發(fā)現(xiàn)在一定時(shí)間內(nèi)4～8℃溫度保存下肝素鈉管、EDTA-k2管、枸櫞酸鈉1:9（檸檬酸鈉1:9）管等3種采血管中的血液乙醇含量穩(wěn)定性較好，進(jìn)一步將此3種管作為血儲(chǔ)容器采取相近血樣后在-20℃溫度保存，結(jié)果EDTA-k2管作為血儲(chǔ)容器時(shí)其血液乙醇穩(wěn)定性最好。隨后以EDTA-k2管作為血儲(chǔ)容器采取相近血樣，探討35～42℃、25～30℃、4～8℃、-20℃這4個(gè)溫度保存下的血液乙醇含量，結(jié)果-20℃溫度條件保存下血液乙醇含量檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性最好。最后在血儲(chǔ)容器和保存溫度選擇研究基礎(chǔ)上，血樣保存在EDTA-k2管中且在-20℃下保存180d，90d以內(nèi)檢測(cè)結(jié)果與最初的結(jié)果接近，90d以后檢測(cè)結(jié)果與最初結(jié)果有偏差甚至偏差較大，經(jīng)-20℃保存溫度下血液乙醇含量隨保存時(shí)間的回歸分析中三次函數(shù)的回歸方程擬合優(yōu)度更高，認(rèn)為90d為酒駕血液有效保存時(shí)間。從而確立了最佳血儲(chǔ)容器為EDTA-k2真空抗凝采血管、最適保存溫度為-20℃及有效保存時(shí)間為90d。

由于研究中采集的均是健康人鮮血，加之血儲(chǔ)容器處于真空、密閉和抗凝狀態(tài)，在研究的測(cè)試時(shí)間內(nèi)可不考慮血液腐敗、揮發(fā)和凝固所產(chǎn)生的影響[12]。至于實(shí)驗(yàn)檢測(cè)中血液乙醇含量為何下降，有待于后期進(jìn)一步研究。

5 結(jié)論

本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了保存溫度、血儲(chǔ)容器、保存時(shí)間對(duì)血液乙醇含量檢測(cè)結(jié)果的影響。研究結(jié)果顯示，血液酒精測(cè)試最佳血儲(chǔ)容器為EDTA-k2真空抗凝管，最適保存溫度為-20℃，保存時(shí)效為90d。建議交管部門(mén)查驗(yàn)酒駕進(jìn)行血液酒精檢測(cè)時(shí)，以EDTA-k2管為血儲(chǔ)容器，-20℃保存90d內(nèi)送檢，確保血液酒精含量檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，彰顯我國(guó)司法的公平正義。