劉文彬 齊一凡 曹軍 吳喜成 周黎明

(1. 四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)2015級(jí)；2. 華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，四川 成都 610041)

薰衣草(LavandulaaspicL)是唇形科(Lamiaceae)的一種強(qiáng)烈芳香的灌木植物，傳統(tǒng)上用于治療多種皮膚病，包括燒傷和潰瘍等。薰衣草精油對(duì)傷口愈合具有一定的保護(hù)作用，不僅能促進(jìn)創(chuàng)面組織修復(fù)、縮短愈合時(shí)間，而且可以抗炎、止痛，甚至減少瘢痕組織增生[1]。同時(shí)在治療過(guò)程中散發(fā)著薰衣草的清香，增添了芳香療法的新理念，可在一定程度上克服傳統(tǒng)治療過(guò)程中患者痛苦及情緒煩躁不安的缺點(diǎn)。已有研究證實(shí)了薰衣草精油具有抗炎、止痛，減少瘢痕組織增生，促進(jìn)創(chuàng)面組織修復(fù)、縮短愈合時(shí)間的作用[2]，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建小鼠燒傷模型，擬探究薰衣草精油對(duì)小鼠皮膚燒傷的治療效果，為薰衣草精油臨床使用拓展適應(yīng)癥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物

自成都達(dá)碩生物科技有限公司購(gòu)得48只SPF級(jí)KM雄性小鼠，體重25±2 g，批號(hào)：SCXK(川)2015-030，分籠飼養(yǎng)，每籠5只。飼養(yǎng)條件：室內(nèi)溫度 23±1oC，相對(duì)濕度50%±5%，自由飲食水，光暗周期為12/12 h。

1.1.2儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)室自制小鼠背部暴露固定器與手持式長(zhǎng)柄阻燃?jí)喊鍩齻b置；KD-BM包埋機(jī)(北京佳源興業(yè)科技有限公司)；奧林巴斯CX23顯微鏡(北京瑞科中儀)；10% 水合氯醛；金萬(wàn)紅軟膏(天津達(dá)仁堂京萬(wàn)紅藥業(yè)有限公司，批號(hào)：Z12020440)；薰衣草精油(濃度98%，上海三抒生物科技有限公司，批號(hào)：QC20170611)；6% 硫化鈉；95% 乙醇。

1.2 方法

1.2.1隨機(jī)分組

按隨機(jī)取樣的原則分為5組，其中完全空白組8只，不做任何處理；模型組、甘油組、金萬(wàn)紅組和薰衣草精油組各10只，分別制備脫毛并燒傷模型。

1.2.2燒傷模型

實(shí)驗(yàn)前一天，用10% 水合氯醛麻醉(5×10-3mL·g-1)麻醉小鼠(下同)，用固定器固定，暴露背部4×4 cm區(qū)域。剪刀剪短背部鼠毛，用棉簽蘸取6%硫化鈉均勻涂抹，直到細(xì)毛脫落并裸露小鼠背部光滑表皮。一人將燒傷裝置壓于小鼠背部無(wú)毛部位，暴露出1.5×2 cm的燒傷窗口，裝置與鼠背間不可留有空隙。助手在窗口內(nèi)滴加95%乙醇，浸滿窗口內(nèi)皮膚并不漏液。打火機(jī)點(diǎn)火，啟動(dòng)秒記時(shí)，到20 s[2]時(shí)用濕紗布熄火。將小鼠從裝置中取出，用吹風(fēng)機(jī)吹干后放回鼠籠。注意保暖與護(hù)理，降低死亡率。當(dāng)天腹腔注射生理鹽水0.4 ml，次日口服牛奶 0.2-0.3 ml[3,4]。

圖1 裝置示意圖注：A：自制手持式長(zhǎng)柄阻燃?jí)喊鍩齻b置；B：自制小鼠背部暴露固定器

1.2.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及治療

模型組不給任何藥物，其余各組自燒傷第2天起每日給2次藥(除第2天處死取樣的小鼠)，甘油組每只涂抹60% 甘油水溶液0.2 ml，金萬(wàn)紅組每次涂抹金萬(wàn)紅軟膏覆蓋燒傷區(qū)域，薰衣草精油組每只涂抹薰衣草精油0.2 ml。共給8天藥，每天正常飼養(yǎng)。

1.2.4皮膚病理學(xué)檢查

于燒傷后第2、4、6、8日各組分別處死1、2、3、3只小鼠，取燒傷部分皮膚做病理學(xué)檢查。

取樣方法：處死小鼠，將燒傷區(qū)域連同周邊正常皮膚約半厘米剪下，平鋪于小片濾紙上，折疊后置于包埋盒中，浸泡于10% 福爾馬林固定。完成固定后，切取4 mm×4 mm×5 μm的一塊皮膚，制備石蠟切片，HE染色后，用顯微鏡觀察并照相[5,6,7]。

1.3 病理學(xué)評(píng)分

標(biāo)準(zhǔn)參考A. Eldad，A. einberg[8〗(表2)，依此對(duì)樣本進(jìn)行病理評(píng)分，采取盲評(píng)、平行評(píng)分原則。評(píng)分結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

表1 顯微鏡下病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 肉眼觀察

自第2日起，模型組創(chuàng)面結(jié)一層深棕色干痂；第6天，創(chuàng)面形成一層厚厚的深茶色干痂，難以揭除，痂下有積液；第8天，創(chuàng)面明顯縮小，周圍有上皮向內(nèi)生長(zhǎng)，但厚焦痂仍不易揭除，痂為肉芽創(chuàng)面。而治療后各組(甘油組,京萬(wàn)紅組和薰衣草精油組)自第2日起創(chuàng)面結(jié)痂，顏色淺，周圍可見(jiàn)液體滲出；第6天，液體逐漸減少，干痂可部分揭除，尤其在第8天，創(chuàng)面明顯縮小，周圍上皮增生明顯，幾乎覆蓋創(chuàng)面，干痂可以大部分或全部揭除。

2.2 顯微鏡下觀察

以第八天病理標(biāo)本為例，可得鏡下結(jié)果圖2示?？梢钥闯觯合噍^于模型組，經(jīng)過(guò)8天的治療，金萬(wàn)紅組和薰衣草精油組均有不錯(cuò)的治療效果，表皮明顯再生，白細(xì)胞輕度浸潤(rùn)，真皮表皮連接明顯修復(fù)，鏡下幾乎看不到水泡。

2.3 病理評(píng)分結(jié)果

表2 病理評(píng)分結(jié)果

注：與模型組相比，*p<0.05 ；與薰衣草精油組相比，#p<0.05。

圖2 第8天各組小鼠背部燒傷上皮組織HE染色(400×)注：A：空白對(duì)照組圖(星號(hào)：上皮完整；箭頭：真皮-表皮連接完整)；B：模型組(星號(hào)：上皮全部損壞/缺失；箭頭：<25%的真皮-表皮連接，有微水皰)；C：甘油組(星號(hào)：上皮部分壞死/潰瘍；箭頭：25%-50%真皮-表皮連接，有微水皰)；D：京萬(wàn)紅組(星號(hào)：上皮輕度壞死；箭頭：25%-50%真皮-表皮連接，有微水皰)；E：薰衣草精油組(星號(hào)：輕度部分壞死；箭頭：50%-75%真皮-表皮連接，無(wú)微水皰)

整體觀察，從起效時(shí)間來(lái)看，與模型組相比，三個(gè)給藥組起效順序?yàn)檗挂虏菥徒M、甘油組和金萬(wàn)紅組，分別在燒傷后第4天、第6天、第8天起作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；從效果來(lái)看，燒傷后第6天薰衣草精油對(duì)燒傷的治療作用要優(yōu)于甘油(P<0.05)；第8天薰衣草精油對(duì)燒傷的治療作用要優(yōu)于甘油組和京萬(wàn)紅組(P<0.05)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)大體標(biāo)本和鏡下標(biāo)本的觀察及對(duì)標(biāo)本的病理評(píng)分，可以得出：薰衣草精油和金萬(wàn)紅對(duì)燒傷均有良好的治愈效果，且薰衣草精油比京萬(wàn)紅起效更快。

3 討論

本次實(shí)驗(yàn)在復(fù)制燒傷小鼠模型的前期過(guò)程中，我們參考了已有文獻(xiàn)中[2]的造模方法，發(fā)現(xiàn)效果并不理想，由此進(jìn)行了改進(jìn)。實(shí)驗(yàn)中采用小電推子脫毛、硬紙片固定燒傷面積、使用酒精點(diǎn)燃的方法進(jìn)行造模，但由于皮膚毛根的殘留導(dǎo)致火勢(shì)不均，難以達(dá)到理想的燒傷效果。我們?cè)俚母倪M(jìn)辦法是使用6%的硫化鈉溶液脫毛，以保證毛根也能清除干凈，使火焰能夠完全燒灼皮膚。此外，較長(zhǎng)時(shí)間的麻醉、脫水，導(dǎo)致小鼠腦部血液循環(huán)不暢，眼睛干涸造模完成后老鼠失明，給后續(xù)實(shí)驗(yàn)造成了不穩(wěn)定的因素。我們的解決辦法是事先在眼球上涂抹眼膏，以保持小鼠眼球濕潤(rùn)防止失明。

燒傷破損面的愈合是自然生理過(guò)程，是對(duì)受損皮膚組織的功能和完整性的恢復(fù)。該過(guò)程分為四個(gè)重疊階段：即凝血、炎癥、新組織形成和組織重塑，特別是新的組織形成和組織重塑。不同細(xì)胞和細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)參與了創(chuàng)面愈合的各個(gè)過(guò)程，參與的細(xì)胞主要有角化細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及血小板等。細(xì)胞因子包括：生長(zhǎng)因子、腫瘤壞死因子、干擾素、集落刺激因子、趨化因子、白細(xì)胞介素。凝血階段主要由血小板、纖維蛋白完成；炎癥反應(yīng)階段主要有中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等參與；增殖期主要由成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞及膠原完成，重塑期主要是膠原纖維的收縮及瘢痕形成[9,10]。

薰衣草精油的主要成分為芳樟醇和乙酸芳樟酯，次要成分為包括β-羅勒烯在內(nèi)的12種成分。已有研究表明薰衣草精油能夠治療燒傷可能與其具有抗炎和抗氧化應(yīng)激作用相關(guān)[11]。本次試驗(yàn)中，進(jìn)行治療第4，6，8天時(shí)薰衣草精油的療效優(yōu)于京萬(wàn)紅，可能是由于用薰衣草精油在燒傷愈合過(guò)程中提高了相關(guān)細(xì)胞和細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)了成纖維細(xì)胞的膠原成熟和合成，并在傷口損傷中誘導(dǎo)I型和III型膠原的表達(dá)。

目前臨床上較多使用的治療燒傷的藥物是磺胺嘧啶銀和京萬(wàn)紅軟膏，但也有其缺點(diǎn)：部分病人會(huì)發(fā)生磺胺過(guò)敏反應(yīng)。結(jié)合我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)論，薰衣草精油治療燒傷的效果同樣顯著，有望作為已有陽(yáng)性藥的替代藥物使用。相關(guān)的研究將在后續(xù)試驗(yàn)中進(jìn)行。