袁秀平,王云云,袁向輝

(楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

柿葉為柿科植物柿(Diospyros kaki L.)的新鮮或干燥葉。柿葉中含有黃酮、鞣質(zhì)、酚類、香豆素類、揮發(fā)油、有機(jī)酸以及豐富的維生素C等多種物質(zhì)[1〗，其中黃酮類化合物是柿葉提取物的主要有效成分，諸如蘆丁、黃芪甙、紫云苷、槲皮素、金絲桃甙等，黃酮類化合物具有降脂、抗血栓、抗氧化、抗衰老、清除自由基等多種藥理活性[2～3],可應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、保健品以及化妝品等行業(yè)，具有極廣的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。柿葉黃酮的提取方法有雙水相萃取法[4]、超聲波提取法[5～7]、大孔樹(shù)脂分離法[8]、微波提取法[6]、纖維素酶提取法[9～10]以及超臨界萃取法[11]等，復(fù)合酶酶解作用對(duì)沙棘和冬棗葉總黃酮提取率均有促進(jìn)作用[12～13]，但利用復(fù)合酶提取柿葉黃酮的工藝研究尚未見(jiàn)報(bào)道，以磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液為提取溶劑探索了植物提取專用復(fù)合酶在柿葉總黃酮提取中的作用，考察酶解提取條件對(duì)總黃酮提取率的影響，優(yōu)化提取工藝，為柿葉的深度開(kāi)發(fā)和綜合利用提供技術(shù)支持和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柿葉：2018年7月采自楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院西校區(qū)校園內(nèi)柿樹(shù)，柿葉采摘清洗后自然風(fēng)干，在恒溫干燥箱烘至恒重，其烘制溫度設(shè)為60℃ ，時(shí)間為3h，用萬(wàn)能粉碎機(jī)將烘干的樣品磨碎，過(guò)50目篩備用。

試劑：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(UV≥98%)，江西佰草源生物科技有限公司；纖維素酶(50 000 IU·g-1)、植物提取專用復(fù)合酶(20 000 IU·g-1)，河北格貝達(dá)生物科技有限公司；無(wú)水乙醇，亞硝酸鈉(NaNO2)、九水合硝酸鋁(Al(NO3)3· 9H2O)、氫氧化鈉(NaOH)、檸檬酸(C4H2O7· H2O)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4· 2H2O)均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

101-3AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；150B搖擺式高速中藥粉碎機(jī)，浙江瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司；FA2004型電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；DZKW型電熱恒溫水浴鍋，天津市大港區(qū)紅杉實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州科豐儀器設(shè)備有限公司；TU-1901型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.05 mg，用60% 乙醇溶解后定容至50 mL容量瓶中，作為標(biāo)準(zhǔn)品原液。分別準(zhǔn)確量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)原液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于25 mL容量瓶中，先加5% NaNO2溶液1.0 mL，5分鐘后加l0% Al( NO3)3 溶液1.0 mL，再5分鐘后加4% NaOH溶液10 mL，用60%乙醇定容，15 min后，在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，作蘆丁濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為 A =0.0091C+0.0041，R2=0.9996。

1.3.2 酶解法提取單因素影響試驗(yàn) 粉碎過(guò)篩的柿葉粉末為樣品，使用磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液作為提取溶劑，選擇生物酶種類、酶用量、緩沖液pH、酶解溫度和酶解提取時(shí)間五個(gè)因素，采用固定其它因素，考察單一因素對(duì)柿葉黃酮提取率影響的方式順次進(jìn)行單因素篩選試驗(yàn)。具體操作方法是：準(zhǔn)確稱取柿葉粉1. 00 g 于具塞三角瓶中，加20 mL緩沖液，添加生物酶，在合適溫度水浴條件下酶解一定時(shí)間后加25 mL無(wú)水乙醇，抽濾，用60%乙醇定容于50 mL，作為待測(cè)樣液。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.3 正交試驗(yàn)法優(yōu)化提取工藝 綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果的分析，選擇對(duì)柿葉黃酮提取率影響較大的因素水平進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化酶解法提取柿葉總黃酮的工藝，優(yōu)選出提取最適條件。

1.3.4 柿葉中總黃酮含量測(cè)定和計(jì)算 量取樣品待測(cè)液 1.0 mL于 25 mL容量瓶中，按1.3.1中方法操作，將所得吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算得提取液中總黃酮含量。按下列公式計(jì)算出總黃酮含量和黃酮提取率：黃酮含量( mg·g-1) = C×25×50 /1 000 W，黃酮提取率/ %= (黃酮含量/1 000)×100%，式中，C為從回歸方程求得的蘆丁濃度(mg·L-1) ，25、50為稀釋倍數(shù)，W為柿葉重(g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解法提取柿葉總黃酮的單因素影響試驗(yàn)

2.1.1 生物酶種類和用量的影響 試驗(yàn)中固定提取溶劑為pH4.8的緩沖液，40℃水浴，酶解提取時(shí)間為60 min，分別考察纖維素酶和復(fù)合酶用量為0、20、40、60、80、100 mg的影響。生物酶種類和用量對(duì)柿葉總黃酮提取率影響見(jiàn)圖2。

圖2 酶用量對(duì)柿葉總黃酮提取率的影響

由圖2可明顯看出，添加生物酶可提高黃酮提取率，且相同用量的復(fù)合酶比單一纖維素酶提取率高，可能是因?yàn)閺?fù)合酶由纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶和β-葡聚糖酶四種酶組成，生物酶之間可發(fā)揮協(xié)同促進(jìn)作用。復(fù)合酶用量在6%時(shí)，提取率明顯升高，之后的增漲幅度非常??；纖維素酶隨著用量的增加，黃酮提取率呈遞增趨勢(shì)，但是總體提取率仍低于復(fù)合酶。

2.1.2 緩沖液pH的影響試驗(yàn) 試驗(yàn)時(shí)分別添加纖維素酶和復(fù)合酶用量固定為60 mg，40℃水浴，酶解提取時(shí)間為60 min，考察提取溶劑緩沖液pH值為4.2、4.8、5.4、6.0、6.6、7.2的影響。緩沖液pH對(duì)柿葉總黃酮提取率影響見(jiàn)圖3。

圖3 緩沖液pH對(duì)柿葉總黃酮提取率的影響

圖3可知，緩沖液pH值的大小對(duì)于柿葉總黃酮的提取率影響較大，復(fù)合酶在pH5.4～6.0左右黃酮提取率達(dá)到5.6%以上，而纖維素酶在pH5.4時(shí)，黃酮提取率達(dá)最高值5.2%，但還是低于復(fù)合酶的促進(jìn)作用。當(dāng)pH超過(guò)6.0后，兩種酶的促進(jìn)作用均明顯下降，幾乎失去生物酶的促進(jìn)作用。可能是由于復(fù)合酶中其它組分的原因，其最適pH和纖維素酶的有差異，但表現(xiàn)出緩沖液pH在4.8～6.0的范圍內(nèi)，酶解法提取黃酮率較高。

2.1.3 酶解溫度的影響試驗(yàn) 試驗(yàn)中固定添加了60 mg復(fù)合酶，pH6.0的緩沖液作為提取溶劑，分別在30、40、50、60、70℃水浴條件下酶解60 min。酶解提取溫度對(duì)黃酮提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 溫度對(duì)柿葉總黃酮提取率的影響

圖4中得知，隨著溫度升高，總黃酮的提取率隨之升高，當(dāng)溫度達(dá)到 50℃ 時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到5.7%，繼續(xù)升溫，總黃酮的提取率急劇下降。可能是因?yàn)殡S溫度升高，酶活性逐漸增大，提取率升高; 當(dāng)溫度超過(guò)60℃時(shí)，酶逐漸失活，總黃酮提取率降低，70℃時(shí)，完全喪失酶的活性，黃酮提取率甚至低于不加酶的對(duì)照組。

2.1.4 酶解時(shí)間的影響試驗(yàn) 試驗(yàn)中添加了60mg復(fù)合酶，pH6.0的緩沖液作為提取溶劑，水浴溫度50℃條件下，考察酶解提取時(shí)間30、60、120和240min時(shí)的黃酮提取率，酶解提取時(shí)間對(duì)柿葉黃酮提取率的影響見(jiàn)圖5。

由圖5 可見(jiàn)，酶解提取剛開(kāi)始階段，黃酮提取率隨時(shí)間延長(zhǎng)呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，1 h后，黃酮含量增長(zhǎng)幅度變小，2 h后幾乎不再增長(zhǎng)，說(shuō)明酶的活性發(fā)揮主要是在60～120 min之間，再延長(zhǎng)提取時(shí)間反而會(huì)影響黃酮提取的純度和組分。

圖5 酶解提取時(shí)間對(duì)柿葉總黃酮提取率的影響

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以柿葉黃酮提取率為考察指標(biāo)，選取酶解提取溫度(A)、緩沖液pH值(B)、添加復(fù)合酶量(C)和酶解提取時(shí)間(D)四因素三水平，按L9(34)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)(見(jiàn)表1)。

表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

從正交試驗(yàn)結(jié)果分析(表2)看出，影響因素的主次順序?yàn)椋簆H值>提取溫度>提取時(shí)間>酶用量，復(fù)合酶輔助提取柿葉總黃酮的最佳工藝條件為為A3B2C2D2，但是該組合并未出現(xiàn)在正交試驗(yàn)組中，因此進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，并設(shè)不加酶的空白對(duì)照。結(jié)果顯示，在最優(yōu)組合條件下，柿葉總黃酮提取率為6.02%，而對(duì)照組的黃酮提取率為4.41%。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)研究基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交優(yōu)化工藝，結(jié)果表明添加復(fù)合酶比單一的纖維素酶更有助于提高柿葉黃酮的提取率。酶解法提取柿葉黃酮的最佳提取條件是：pH5.8的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液為提取溶劑、復(fù)合酶用量為70 mg·g-1、提取溫度為45℃恒溫水浴、提取時(shí)間90 min，在該條件下，柿葉黃酮提取率達(dá)6.02%，比不加酶的對(duì)照組提高了36.5%。 此法具有成本低，得率高的優(yōu)勢(shì)，可為柿葉總黃酮的提取工藝研究和優(yōu)化提供參考價(jià)值。