羅 雨，許 佳，張超穎，蔣春燕，章紅兵

(金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)檢測中心，浙江 金華 321000)

白介素-17(IL-17)細(xì)胞因子家族包括6個(gè)成員：IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E(也稱 IL-25)和 IL-17F[1]。IL-17C主要表達(dá)于腸道等粘膜組織中的上皮細(xì)胞，能誘導(dǎo)緊密連接蛋白及抗菌蛋白的表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)腸粘膜免疫[2-4]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，豬腸上皮細(xì)胞系IPEC-J2在細(xì)菌感染后能通過上調(diào)IL-17C的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)粘膜免疫[5]。金華豬，又稱“金華兩頭烏”，是我國著名的優(yōu)良豬種之一，具有肉質(zhì)好、繁殖率高、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)良特性。長白豬具有生長速度快和飼料利用率高，但該品種抗病能力相對較差[6]。為進(jìn)一步研究IL-17C在豬腸道免疫中的作用，本文對比分析了IL-17C細(xì)胞因子在金華豬與長白豬腸道中的表達(dá)特性，以期從分子水平揭示兩品種豬抗病性能差異的原因。

1 材料與方法

1.1樣品采集 選取180 日齡去勢金華公豬和長白公豬各6頭，屠宰后分別采集空腸及回腸中段組織。用預(yù)冷的生理鹽水沖洗掉內(nèi)容物后，分別浸入于含TRIzol Reagent(Thermo Fisher Scientific)的1.5 mL EP管中或者含甲基纖維素(Sigma-Aldrich)的平底凍存管中，然后投入液氮中迅速冷凍后置于-80℃冰箱保存。

1.2qRT-PCR 按照Trizol Reagent的操作說明提取腸道組織中的總RNA，選取1 μg純化后的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后以GAPDH和β-actin為內(nèi)參基因，利用qRT-PCR方法檢測IL-17C mRNA在金華豬與長白豬空腸及回腸中的表達(dá)量。引物及退火溫度見表1，具體操作方法參考文獻(xiàn)[5]。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.3腸道組織切片及染色鏡檢 切片制作及染色方法參考文獻(xiàn)[7]，一抗與熒光二抗分別為兔抗-IL-17C (1:1000，ab153896，Abcam)及羊抗兔異硫氰酸熒光素?zé)晒舛?碧云天)。染色完成后用0.223 M 1,4-二氮雜二環(huán) [2.2.2] 辛烷(Sigma-Aldrich)的甘油封片后熒光顯微鏡鏡檢(奧林巴斯BX43)。

1.4數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用SPSS 22軟件進(jìn)行Mann-Whitney U檢驗(yàn)和Friedman′s測試，所有數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1IL-17C基因在不同腸道中的表達(dá) 由圖1可見，IL-17C基因在金華豬及長白豬空腸及回腸中均有表達(dá)，且在不同品種間存在差異。金華豬腸道IL-17C基因表達(dá)量均高于長白豬，其中在空腸中的表達(dá)量顯著高于長白豬(P<0.05)。同時(shí)，兩品種豬IL-17C基因在不同腸道部位的表達(dá)存在明顯差異，回腸中的基因表達(dá)量顯著高于空腸(P<0.01)。

圖1 IL-17C基因在金華豬和長白豬腸道中的表達(dá)(不同字母代表差異顯著)

2.2IL-17C蛋白在空腸中的表達(dá) 免疫熒光結(jié)果顯示，金華豬IL-17C蛋白在空腸中的表達(dá)顯著高于長白豬，且主要集中于隱窩處(圖2，右向箭頭所示)。此外，在金華豬腸絨毛上皮細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)有IL-17C的表達(dá)(圖2，左向箭頭所示)，而在長白豬腸上皮細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)該蛋白的存在。

圖2 金華豬及長白豬空腸中IL-17C蛋白免疫熒光檢測

3 討論

IL-17C基因在腸道中的主要作用是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和維持粘膜屏障功能[8]。目前，關(guān)于IL-17C及其腸道免疫調(diào)節(jié)的研究主要集中于人及小鼠模型中。本團(tuán)隊(duì)前期研究表明，IL-17C基因能表達(dá)于豬腸上皮細(xì)胞系IPEC-J2中[5]。本試驗(yàn)進(jìn)一步研究了IL-17C在豬腸道組織中的分布規(guī)律，發(fā)現(xiàn)IL-17C細(xì)胞因子在金華豬及長白豬腸道中的表達(dá)存在明顯差異。在金華豬腸道內(nèi)，尤其是空腸IL-17C的表達(dá)量顯著高于長白豬。IL-17C主要表達(dá)于隱窩處的腸上皮細(xì)胞，與在人腸道中的研究結(jié)果一致[9]。有研究表明，金華豬腸道內(nèi)β-防御素-2 (pBD-2)等防御蛋白的水平顯著高于長白豬[10]。在豬腸上皮細(xì)胞中，IL-17C能夠調(diào)控黏膜免疫相關(guān)基因(pBD-2，mucin-2，claudin-1和claudin-2)的表達(dá)，進(jìn)而能有效抵抗細(xì)菌的感染和入侵[5]。因此，IL-17C可能在豬腸道先天免疫中發(fā)揮著重要的作用。IL-17C在金華豬及長白豬腸道的表達(dá)差異可能從分子水平闡釋了地方品種豬抗病力優(yōu)于引進(jìn)品種豬的機(jī)制。本研究為進(jìn)一步研究不同品種豬腸道免疫力及抗病力之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。