釓貝葡胺合成中間體BOPTA有關(guān)物質(zhì)的制備及結(jié)構(gòu)鑒定

方欽虎 沈偉藝 曾德云 郭鵬飛

摘 要：目的：對合成釓貝葡胺的中間體BOPTA工藝中所含的未知雜質(zhì)進(jìn)行了分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定。方法：基于制備液相色譜，優(yōu)化色譜分離參數(shù)，通過兩步分離純化，制備BOPTA及其2個未知雜質(zhì)。借助質(zhì)譜和核磁技術(shù)對雜質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。結(jié)果：2個未知雜質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定為 2，2-（1，9-dicarboxy-12-phenyl-11-oxa-2，5，8-triazadodecane-5，8-diyl）diacetic acid（雜質(zhì)1）、4-carboxy-8-（carboxymethyl）-1-phenyl-2-oxa-5，8，11-triazatridecan-13-oic acid（雜質(zhì)2）。結(jié)論：本研究為藥物及醫(yī)藥合成中間體雜質(zhì)的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定提供借鑒。

關(guān)鍵詞：釓貝葡胺；BOPTA；制備液相色譜；分離純化；雜質(zhì)

中圖分類號：TQ421.3+6 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1671-2064（2019）11-0195-02

0 引言

釓貝葡胺的合成工藝是以BOPTA（4-羧基-5，8，11-三（羧甲基-1-苯基-2-氧雜-5，8，11-三氮雜十三烷-13-酸））為原料，與三氧化二釓發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)得到釓貝酸，再投入葡甲胺絡(luò)合得到[1]。BOPTA是釓貝葡胺合成的關(guān)鍵中間體，在其質(zhì)量控制方面起著重要作用。雜質(zhì)產(chǎn)生機(jī)理，雜質(zhì)結(jié)構(gòu)確證和雜質(zhì)限量控制已經(jīng)成為藥品質(zhì)量的重要研究內(nèi)容[2]。對于雜質(zhì)的研究，目前常利用現(xiàn)代儀器設(shè)備和各種分析表征手段對雜質(zhì)進(jìn)行富集、純化制備和結(jié)構(gòu)鑒定。目前對于BOPTA生產(chǎn)工藝中產(chǎn)生的雜質(zhì)仍沒有被報(bào)道。高效液相色譜法（HPLC）是目前制藥領(lǐng)域廣泛使用的分離分析技術(shù)[3-6]。HPLC采用粒度均勻的小顆粒填料和自動化儀器，具有高柱效、重復(fù)穩(wěn)定和在線監(jiān)測等優(yōu)點(diǎn)。施猛等人使用HPLC對于釓貝葡胺注射液中葡甲胺的含量進(jìn)行了研究[7]。本文基于制備液相色譜技術(shù)，通過兩步制備方法，獲得BOPTA和2個相關(guān)雜質(zhì)，并對雜質(zhì)進(jìn)行了純度分析、質(zhì)譜和核磁的結(jié)構(gòu)表征。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

磷酸二氫鉀（純度≥99.0%）購于上海泰坦科技股份有限公司；制備級乙腈購于上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆籋PLC級磷酸、乙腈購自中國百靈威公司；實(shí)驗(yàn)用水由Milli-Q純化系統(tǒng)（美國Millipore公司）制備；BOPTA粗品由浙江司太立制藥股份有限公司車間合成。

BOPTA樣品分析及方法優(yōu)化采用Waters Alliance e2695高效液相色譜儀，包括四元梯度泵、自動進(jìn)樣器、2489 UV/Visible檢測器、在線脫氣機(jī)、柱溫箱和EmpowerTM 3.0色譜工作站（美國Waters公司）；分離純化采用Waters純化系統(tǒng)包括2545二元梯度泵、2489 UV/Visible檢測器、2767餾分收集模塊和Masslynx 4.1操作軟件；高分辨質(zhì)譜采用Agilent HPLC1260-QTof 6520液質(zhì)聯(lián)用儀；核磁表征在Bruker AVANCE III-600 MHz超導(dǎo)核磁共振波譜儀完成。分析柱Unitary C18和XAqua（250mm×4.6mm，5μm）、制備柱Unitary C18和XAqua C18（250mm×20mm，10μm）購于浙江華譜新創(chuàng)科技有限公司。

1.2 純化制備

BOPTA樣品加水溶解，濃度為300mg/mL。在制備柱XAqua C18（250mm×20mm，10μm）上進(jìn)行初次分離。采用20mM磷酸二氫鉀（pH=3.0）（A）-乙腈（B）為流動相，梯度洗脫0-30min，7-18%B，流速20mL/min，進(jìn)樣體積1mL，檢測波長215nm。經(jīng)初次制備共獲得3個餾分，記為Fr 1～Fr 3。

餾分Fr1～Fr3經(jīng)濃縮后，在Unitary C18制備柱上進(jìn)行二次純化。以20 mM 磷酸二氫鉀（pH=3.0）（A）-乙腈（B）為流動相等度洗脫。餾分經(jīng)濃縮、脫鹽、凍干處理，共獲得Fr 1-1（impurity 1，54.8mg），F(xiàn)r 2-1（impurity 2，64.7mg），F(xiàn)r 3-1（BOPTA，800.5 mg），。通過純度分析、高分辨質(zhì)譜、1H-NMR和13C-NMR表征確定化合物的結(jié)構(gòu)（圖1）。

2 結(jié)果與討論

在4.6mm內(nèi)徑的分析柱上進(jìn)行條件優(yōu)化后，在20mm的制備柱上開展放大制備實(shí)驗(yàn)。初次制備條件見1.2節(jié)，制備圖如圖2（A）所示，獲得餾分Fr.1～Fr.3。盡管一次洗脫液中雜質(zhì)成分純度較低，但組分較為簡單，便于二次制備高純度雜質(zhì)。餾分采用低溫旋蒸脫去有機(jī)溶劑，再進(jìn)行第二次純化。由于成分相對簡單，實(shí)驗(yàn)采用了等度洗脫條件和連續(xù)進(jìn)樣方式，提高了制備效率。以餾分Fr 2為例，單針運(yùn)行時間為20min，而采用連續(xù)進(jìn)樣方式，進(jìn)樣間隔分別為13min。單位時間內(nèi)（100min），制備效率提高了1.6倍。圖2（B）為連續(xù)制備圖，圖中紅色箭頭表示進(jìn)樣時間點(diǎn)。通過二次分離純化，從BOPTA樣品中制備獲得BOPTA和2個相關(guān)物質(zhì)。

3 結(jié)構(gòu)表征

制備所得化合物經(jīng)過純度分析、質(zhì)譜、1H-NMR和13C-NMR進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。純度分析結(jié)果：雜質(zhì)1（99.1%）、雜質(zhì)2（98.2%）和BOPTA（99.2%）。

雜質(zhì)1：白色粉末，UV λmax 205nm，ESI-MS m/z： 454.1899 [M-H]-，結(jié)合1H-和13C-NMR譜數(shù)據(jù)推測分子式為C20H29N3O9，1H-NMR（600MHz，D2O）δ：7.45（5H，m， H16-20），4.61（6H，m，H5-7）.13C-NMR（150MHz，D2O）δ：169.9（C-1），169.2（C-2），163.9（C-3），167.6（C-4），53.9（C-5），59.7（C-6），60.4（C-7），65.7（C-8），65.1（C-9），73.3（C-10），41.0（C-11），55.2（C-12），51.7（C-13），42.2（C-14），136.8 （C-15），128.7（C-16），128.9（C-17），128.6（C-18），128.9（C-19），128.7（C-20）.鑒定該化合物為2，2-（1，9-dicarboxy-12-phenyl-11-oxa-2，5，8-triazadodecane-5，8-diyl）diacetic acid。

雜質(zhì)2：白色粉末，UV λmax 205nm，ESI-MSm/z： 396.1892 [M-H]-，結(jié)合1H-和13C-NMR譜數(shù)據(jù)推測分子式為C18H27N3O7，1H-NMR（600MHz，D2O）δ：7.40（5H，m，H14-18），4.39（1H，s，H-6）.13C-NMR（150MHz，D2O）δ：169.4（C-1），169.2（C-2），166.0（C-2），47.9（C-4），55.3（C-5），66.2（C-6），66.7（C-7），73.26（C-8），43.1（C-9），53.4（C-10），55.7（C-11），42.9（C-12），136.7（C-13），128.5（C-14），128.8（C-15），128.5（C-16），128.8（C-17），128.5（C1-8）.鑒定該化合物為4-carboxy-8-（carboxymethyl）-1-phenyl-2-oxa-5，8，11-triazatridecan-13-oic acid。

BOPTA：白色粉末，UV λmax 205nm，ESI-MS m/z： 512.1903[M-H]-，結(jié)合1H-和13C-NMR譜數(shù)據(jù)推測分子式為C22H31N3O11，1H-NMR（600MHz，D2O）δ：7.36（5H，m，H18-22），4.12（1H，s，H10），3.41-3.18（8H，m，H13-16）.13C -NMR（150MHz，D2O）δ：170.5（C-1），170.5（C-2），172.5（C-3），171.1（C-4），172.1（C-5），56.1（C-6），56.1（C-7），54.3（C-8），53.9（C-9），66.6（C-10），66.0（C-11），73.2（C-12），51.6（C-13），50.8（C-14），51.2（C-15），50.0（C-16），136.9（C-17），128.5（C-18），128.8（C-19），128.4（C-20），128.8（C-21），128.5（C-22）。鑒定該化合物為BOPTA。

4 結(jié)語

在藥物合成反應(yīng)過程中不可避免地會產(chǎn)生雜質(zhì)，故研究合成產(chǎn)物的雜質(zhì)，有利于了解合成過程與方法的合理性，以期對工藝進(jìn)行評估和改進(jìn)，從而對于藥物的安全性提供保障。本實(shí)驗(yàn)基于制備液相色譜法，以BOPTA粗品為原料，優(yōu)化色譜分離純化參數(shù)，并放大到制備水平，采用兩步純化方法制備了BOPTA和2個相關(guān)雜質(zhì)，為其質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

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