青藤堿對兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型組織形態(tài)學(xué)及關(guān)節(jié)液炎性細(xì)胞和聚集蛋白聚糖酶含量的影響

鄭潔 趙莉平 胡亞莉 袁普衛(wèi)

摘要：目的? 觀察不同劑量青藤堿對兔膝骨關(guān)節(jié)炎（OA）模型關(guān)節(jié)軟骨和滑膜組織形態(tài)學(xué)及關(guān)節(jié)液白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-17及聚集蛋白聚糖酶（ADAMTS）-4、ADAMTS-5含量的影響。方法? 采用Hulth法建立OA模型。將50只新西蘭大白兔隨機(jī)分為空白組、模型組和青藤堿低、中、高劑量組?？瞻捉M不予任何處理，模型組給予生理鹽水、給藥組給予鹽酸青藤堿注射液膝關(guān)節(jié)腔注射，共干預(yù)10次，青藤堿給藥量分別為0.2 mL（5 mg）、0.35 mL（8.75 mg）和0.5 mL（12.5 mg）。干預(yù)結(jié)束后取關(guān)節(jié)軟骨行番紅O染色，取滑膜組織行HE染色，進(jìn)行組織學(xué)評分;ELISA檢測關(guān)節(jié)液IL-6、IL-17、ADAMTS-4和ADAMTS-5含量。結(jié)果? 模型組軟骨Mankins評分和滑膜組織病理學(xué)評分顯著高于空白組（P<0.01），青藤堿中、高劑量組軟骨Mankins評分和滑膜評分顯著低于模型組（P<0.05，P<0.01）;模型組關(guān)節(jié)液IL-6、IL-17、ADAMTS-4和ADAMTS-5含量較空白組顯著升高（P<0.01），青藤堿中、高劑量組關(guān)節(jié)液IL-6、IL-17、ADAMTS-4和ADAMTS-5含量較模型組顯著降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論? 中、高劑量青藤堿對OA模型病變軟骨具有保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：青藤堿;骨性關(guān)節(jié)炎;白細(xì)胞介素-6;白細(xì)胞介素-17;聚集蛋白聚糖酶;兔

中圖分類號：R285.5??? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）06-0051-04

Abstract： Objective To observe the effects of different concentrations of sinomenine （SIN） on morphology of synovium and cartilage and contents of IL-6， IL-17， ADAMT-4 and ADAMT-5 in synovial fluid of rabbit knee osteoarthritis model. Methods After establishing the knee osteoarthritis model by Hulth method， the New Zealand white rabbits were randomly divided into control group， model group， SIN low-， medium- and high-dosage groups. Control group did not receive any treatment. Model group and other administration group received saline and SIN knee joint injection， for 10 times. The dosages of SIN were 0.2 mL （5 mg）， 0.35 mL （8.75 mg）， and 0.5 mL（12.5 mg）， respectively. After intervention， the articular cartilage was stained with Safranin O， and the synovium was taken for HE staining and histological scoring. The levels of IL-6， IL-17， ADAMTS-4 and ADAMTS-5 in joint fluid were detected by ELISA. Results Mankins scores of articular cartilage and histological scores of synovium in model group were significantly higher than control group （P<0.01）， and the Mankin's score and synovial score in SIN medium- and high-dosage groups were significantly lower than those in the model group （P<0.05， P<0.01）. The levels of IL-6， IL-17， ADAMTS-4 and ADAMTS-5 in the model group were significantly higher than those in the control group （P<0.01）. The levels of IL-6， IL-17， ADAMTS-4 and ADAMTS-5 in SIN medium- and high-dosage groups were significantly lower than those in the model group （P<0.05， P<0.01）. Conclusion SIN medium and high dosage can delay the degradation of articular cartilage of osteoarthritis model.

Keywords： sinomenine; osteoarthritis; IL-6; IL-17; ADAMTS; rabbits

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）通常被視為因增齡及生物力學(xué)機(jī)制改變等因素引起的，以關(guān)節(jié)軟骨損傷為中心并累及關(guān)節(jié)周圍多種組織的退行性關(guān)節(jié)病。近年研究發(fā)現(xiàn)，包括滑膜炎性反應(yīng)在內(nèi)的生物學(xué)因素在OA進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，滑膜炎不僅是引起OA患者關(guān)節(jié)腫痛、關(guān)節(jié)功能障礙的重要因素，且與軟骨退變程度及骨贅形成密不可分[1]。應(yīng)用高分辨率成像模式及關(guān)節(jié)鏡可視化技術(shù)的研究發(fā)現(xiàn)，滑膜炎在OA關(guān)節(jié)軟骨退變發(fā)生之前就已出現(xiàn)[2]。對有臨床癥狀但無影像學(xué)改變的OA患者動態(tài)膝關(guān)節(jié)鏡檢查顯示，滑膜炎與膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)軟骨丟失的未來發(fā)展聯(lián)系緊密[3]。磁共振成像研究也得出類似結(jié)果，即滑膜炎性反應(yīng)程度與OA進(jìn)程密切相關(guān)[4]。青藤堿是從防己科藤本植物青風(fēng)藤中提取的生物堿單體，為青風(fēng)藤的主要活性成分。我們前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿具有抑制木瓜蛋白酶誘導(dǎo)的兔膝OA滑膜炎性反應(yīng)及保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的作用[5]。本研究進(jìn)一步觀察不同劑量青藤堿對Hulth法誘導(dǎo)膝OA模型兔關(guān)節(jié)液炎癥因子白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-17及帶有血小板凝血酶敏感蛋白結(jié)構(gòu)域的解聚素與金屬蛋白酶家族成員中聚集蛋白聚糖酶（ADAMTS）-4、ADAMTS-5含量，以及關(guān)節(jié)滑膜和軟骨組織形態(tài)學(xué)的影響，為青藤堿在OA的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 動物與分組

新西蘭大白兔50只，雌雄各半，體質(zhì)量2.0～2.4 kg，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物合格證號SCXK（陜）2014-003。標(biāo)準(zhǔn)飼料、單籠喂養(yǎng)，室溫20～25 ℃，相對濕度45%～60%，每日正常光照，自由攝食飲水。適應(yīng)環(huán)境1周后，隨機(jī)分為空白組、模型組和青藤堿低、中、高劑量組，每組10只。

1.2? 藥物、試劑與儀器

鹽酸青藤堿注射液，湖南正清制藥集團(tuán)股份有限公司，批號1607405;IL-6、IL-17、ADAMTS-4和ADAMTS-5 ELISA試劑盒，北京諾博萊科技有限公司;Bio-Tec ELX808型酶標(biāo)儀（美國Bio-Tec公司），超薄切片機(jī)（德國LEICA公司），ZEISS研究級正置數(shù)碼顯微鏡（德國ZEISS公司）。

1.3? 造模

采用Hulth法[6]建立兔膝OA模型。10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉，將兔仰臥后固定右膝關(guān)節(jié)于屈曲位，膝關(guān)節(jié)剪毛、常規(guī)消毒，采用內(nèi)側(cè)切口暴露關(guān)節(jié)腔，直視下切除內(nèi)側(cè)半月板，切斷前、后交叉韌帶，生理鹽水沖洗切口，使用4-0號縫線逐層關(guān)閉切口，術(shù)后注射青霉素預(yù)防傷口感染。術(shù)后6周隨機(jī)處死2只兔行關(guān)節(jié)軟骨病理學(xué)檢查，結(jié)果顯示典型軟骨退變，同時(shí)行為學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)兔右膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)腫脹、跛行，表明造模成功。按鹽酸青藤堿注射液成人用藥劑量（2 mL/次），按Meeh-Rubner公式計(jì)算人兔等效劑量。青藤堿低、中、高劑量組膝關(guān)節(jié)腔注射鹽酸青藤堿注射液，用量分別為0.2 mL（5 mg）、0.35 mL（8.75 mg）、0.5 mL（12.5 mg），模型組膝關(guān)節(jié)腔注射0.2 mL生理鹽水，每3 d干預(yù)1次，共干預(yù)10次，空白組不予處理。

1.4? 組織形態(tài)學(xué)觀察

1.4.1? 軟骨組織

干預(yù)結(jié)束后，切取右膝內(nèi)側(cè)脛骨平臺軟骨，15%中性甲醛溶液固定72 h后，EDTA脫鈣，石蠟包埋，進(jìn)行番紅O染色。光學(xué)顯微鏡下對軟骨組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，每張切片選擇3個(gè)不同的視野，參照Mankins關(guān)節(jié)軟骨病理評分標(biāo)準(zhǔn)[7]進(jìn)行評分。

1.4.2? 滑膜組織

取右膝髕骨下滑膜組織，10%中性甲醛固定，石蠟包埋，HE染色。每張切片選擇3個(gè)不同的視野，對滑膜里襯層細(xì)胞及滑膜下組織進(jìn)行觀察并評分?；だ镆r層細(xì)胞觀察內(nèi)容為增生、肥大和炎性細(xì)胞浸潤，滑膜下組織觀察內(nèi)容為肉芽組織增生、血管組織長入和炎性細(xì)胞浸潤，均按無、輕、中、重分別計(jì)0、1、2、3分[8]。

1.5? 關(guān)節(jié)液相關(guān)因子含量測定

干預(yù)結(jié)束后，右膝關(guān)節(jié)腔生理鹽水沖洗法取關(guān)節(jié)液，ELISA測定關(guān)節(jié)液IL-6、IL-17、ADAMTS-4和ADAMTS-5含量，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.6? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，多組數(shù)據(jù)間比較用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1? 軟骨組織形態(tài)學(xué)觀察及Mankins評分結(jié)果

空白組軟骨表面平整光滑，軟骨結(jié)構(gòu)層次清晰，著色均勻，軟骨細(xì)胞分布均勻;模型組軟骨坍塌，結(jié)構(gòu)層次嚴(yán)重紊亂，細(xì)胞數(shù)顯著減少甚至消失，潮線模糊不清;青藤堿低劑量組軟骨表面粗糙不平整，軟骨自表層出現(xiàn)多處裂隙深達(dá)放射層，軟骨細(xì)胞明顯減少，潮線無法辨識;青藤堿中、高劑量組軟骨結(jié)構(gòu)完整，表層粗糙不平整，軟骨細(xì)胞數(shù)彌漫性增多，潮線清晰完整。見圖1。與空白組比較，模型組Mankins評分顯著升高（P<0.01）;與模型組和青藤堿低劑量組比較，青藤堿中、高劑量組Mankins評分明顯降低（P<0.05，P<0.01）。見表1。

2.2? 滑膜組織形態(tài)學(xué)觀察及評分結(jié)果

空白組滑膜薄而細(xì)胞數(shù)少，無炎性細(xì)胞浸潤;模型組滑膜里襯層顯著增厚，全層均有炎性細(xì)胞浸潤，滑膜下層有肉芽組織生成，伴血管增生;青藤堿低劑量組滑膜里襯層增厚，滑膜細(xì)胞肥大，炎性細(xì)胞浸潤明顯;青藤堿中、高劑量組里襯層少許炎性細(xì)胞浸潤。見圖2。與空白組比較，模型組滑膜評分顯著升高（P<0.01）;與模型組和青藤堿低劑量組比較，青藤堿中、高劑量組滑膜評分顯著降低（P<0.01），2組評分無顯著差異（P>0.05）。見表2。

2.3? 青藤堿對模型兔關(guān)節(jié)液相關(guān)因子含量的影響

與空白組比較，模型組兔關(guān)節(jié)液IL-6、IL-17、ADAMTS-4和ADAMTS-5含量顯著升高（P<0.01）;與模型組和青藤堿低劑量組比較，青藤堿中、高劑量組兔關(guān)節(jié)液IL-6、IL-17、ADAMTS-4和ADAMTS-5含量顯著降低（P<0.05，P<0.01）。見表3。

3? 討論

OA是與增齡、肥胖、機(jī)械壓力和損傷等多種因素相關(guān)的復(fù)雜性關(guān)節(jié)疾病，其具體發(fā)病機(jī)制仍不明確。目前普遍認(rèn)為，關(guān)節(jié)軟骨微環(huán)境變化導(dǎo)致的軟骨細(xì)胞合成代謝與分解代謝的不平衡是造成軟骨退變的核心問題，軟骨細(xì)胞分解代謝超過合成代謝，導(dǎo)致構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)膠原的破壞和蛋白聚糖的流失[9]。近年來滑膜炎性反應(yīng)在OA病理生理中作用日益受到關(guān)注，并被認(rèn)為與力學(xué)因素發(fā)揮著同等重要的作用[10]。炎性環(huán)境下，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-1β、IL-6、IL-17等促炎細(xì)胞因子含量顯著提高，這些炎性細(xì)胞因子進(jìn)而促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和ADAMTS含量及活性顯著上調(diào)，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞外基質(zhì)分解代謝超過合成代謝[11]。IL-17作為促炎細(xì)胞因子，在自身免疫性疾病發(fā)病中發(fā)揮著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-17在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜中呈高表達(dá)[12]，IL-17能促進(jìn)軟骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和骨細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性細(xì)胞因子，還可促進(jìn)MMPs的合成，提高破骨細(xì)胞活性，抑制成骨細(xì)胞活性[13-15]。近年研究表明，IL-17在OA病理中也發(fā)揮著重要作用。OA患者關(guān)節(jié)液IL-17顯著升高，且IL-17水平與膝關(guān)節(jié)疼痛嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，阻斷IL-17信號通路可以緩解關(guān)節(jié)疼痛[13]。MMPs和ADAMTS是在成年軟骨中參與軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解的主要蛋白酶，OA病理生理中，MMPs主要參與膠原的降解，而ADAMTS則與聚集蛋白聚糖的流失密切相關(guān)，其中尤以ADAMTS-4和ADAMTS-5的表達(dá)量和分解效率最高[16]。

青風(fēng)藤為防己科植物青藤及毛青藤的干燥藤莖，具有通絡(luò)、止痛、祛風(fēng)濕之功效，主治風(fēng)濕及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)腫大、肢體疼痛、麻木等[17]?，F(xiàn)代藥理研究表明，青藤堿是青風(fēng)藤中主要活性生物堿，具有祛風(fēng)鎮(zhèn)痛、消炎、免疫抑制、降壓及抗心律失常等作用[17]。課題組前期研究表明，青藤堿可抑制木瓜蛋白酶誘導(dǎo)的膝OA模型兔滑膜炎性反應(yīng)，降低關(guān)節(jié)液中MMP-13的含量，對軟骨具有保護(hù)作用[5]。本實(shí)驗(yàn)病理學(xué)觀察顯示，中、高劑量青藤堿干預(yù)后，軟骨Mankins評分及滑膜評分均明顯降低;ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，中、高劑量青藤堿可明顯降低關(guān)節(jié)液IL-6、IL-7、ADAMTS-4和ADAMTS-5含量，而低劑量青藤堿上述作用并不明顯，表明青藤堿抑制膝OA滑膜炎和保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的作用與劑量密切相關(guān)，其中以中、高劑量青藤堿作用更顯著。

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