鐵棒錘種子蛋白質(zhì)提取及聚丙烯酰胺凝膠電泳研究

陸國(guó)弟 楊扶德 陳紅剛 王惠珍 杜弢 邢豪

摘要：目的? 構(gòu)建適合鐵棒錘種子蛋白質(zhì)研究的聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）體系，為鐵棒錘種子純度檢測(cè)及鑒別研究提供技術(shù)支撐。方法? 采用6種蛋白質(zhì)提取法提取伏毛鐵棒錘種子蛋白質(zhì)，并篩選出最佳提取方法，在此基礎(chǔ)上研究不同分離膠濃度、料液比、上樣量對(duì)伏毛鐵棒錘種子蛋白電泳分離效果的影響，并采用篩選出的蛋白質(zhì)最佳提取分離方法對(duì)鐵棒錘和伏毛鐵棒錘種子進(jìn)行鑒定。結(jié)果? 巰基乙醇法提取的伏毛鐵棒錘種子蛋白質(zhì)電泳圖譜效果較佳，電泳譜帶數(shù)最多（14條）、最清晰，適合于其種子純度檢測(cè);分離膠濃度為15%、料液比為1∶10（M/V）、蛋白上樣量稀釋5倍時(shí)，其種子蛋白質(zhì)電泳分離效果較好;鐵棒錘和伏毛鐵棒錘種子蛋白質(zhì)電泳圖譜在蛋白質(zhì)譜帶位置和強(qiáng)弱上有一定差異。結(jié)論? 本研究建立的鐵棒錘種子蛋白樣品制備方法及SDS-PAGE技術(shù)可用于鐵棒錘種子純度檢測(cè)，其蛋白質(zhì)圖譜可作為鐵棒錘與伏毛鐵棒錘種子的鑒別依據(jù)。

關(guān)鍵詞：鐵棒錘;種子;聚丙烯酰胺凝膠電泳;蛋白質(zhì)提取;鑒定

中圖分類號(hào)：R284.2??? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A??? 文章編號(hào)：1005-5304（2019）06-0064-06

Abstract： Objective To establish the appropriate SDS-PAGE system for study on protein from Aconitum pendulum Busch. seeds; To provide technical support for the purity detection and identification of Aconitum pendulum Busch. seeds. Methods Six protein extraction methods for Aconitum pendulum Busch. seeds were tested， and the best extraction method was selected out. Based on the optimal extraction method， the effects of different separation gel concentrations， solid-liquid ratios and sample loadings on the electrophoretic separation of protein from Aconitum pendulum Busch. seeds were studied. The optimal protein extraction and separation method was used to identify seeds of Aconitum pendulum Busch. and Aconitum flavum Hand. Mazz. Results The electrophoresis pattern of Aconitum flavum Hand. Mazz. extracted by thiol ethanol method was better， and the electrophoresis band number was the most （14） and the clearest， which were suitable for its seed purity detection. When the concentration of separation gel was 15%， the ratio of material to liquid was 1：10 （M/V）， and the amount of protein sample was diluted by 5 times， the separation effect of seed protein was better. The electrophoresis patterns of Aconitum pendulum Busch. and Aconitum flavum Hand. Mazz. had some differences in the position and strength of the protein bands. Conclusion The developed methods of seed protein extracting and SDS-PAGE electrophoresis technique can be used for seed purity detection， and the protein fingerprints can be applied to identify seeds of Aconitum pendulum Busch. and Aconitum flavum Hand. Mazz.

Keywords： Aconitum pendulum Busch.; seed; SDS-PAGE; extraction of protein; identification

鐵棒錘為毛茛科植物鐵棒錘Aconitum pendulum Busch.和伏毛鐵棒錘Aconitum flavum Hand. Mazz.的干燥塊根和幼苗，收載于《中華本草·藏藥卷》[1]，具祛瘀活絡(luò)、止血鎮(zhèn)痛等功效，臨床常用于跌打損傷、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)痛、骨折等的治療，療效顯著[2-3]。

近年來，隨著市場(chǎng)需求的增加，鐵棒錘野生資源急劇下降，開始由野生轉(zhuǎn)為人工栽培，其繁殖方式主要是種子繁殖[4]，故種子的檢驗(yàn)是保證種子質(zhì)量的重要措施，也是保證藥材品種和質(zhì)量的重要前提[5]。種子所含蛋白的種類和數(shù)量攜帶了其長(zhǎng)期演化的遺傳特征，具有很高的穩(wěn)定性、專屬性。而種子蛋白電泳技術(shù)具有不需將種子萌發(fā)、送檢樣品可及時(shí)分析等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于植物和農(nóng)作物的純度測(cè)定、品種鑒定和親緣關(guān)系分析[6]，在中藥材種子鑒別、品種純度測(cè)定方面也開始應(yīng)用[7-9]。目前有關(guān)鐵棒錘種子的研究主要集中在化學(xué)成分及品質(zhì)方面[10-11]，其種子蛋白研究尚未見報(bào)道，因而利用電泳圖譜鑒定鐵棒錘種子純度的方法值得探究。本試驗(yàn)采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）技術(shù)研究鐵棒錘種子蛋白質(zhì)提取的最適宜方法和電泳條件，建立適用于其種子鑒別的SDS-PAGE技術(shù)體系，為鐵棒錘種質(zhì)資源的保護(hù)、評(píng)價(jià)、種子鑒定、純度測(cè)定提供依據(jù)。

1? 儀器與試藥

DYY-10C型電泳儀（北京市六一儀器廠），DYCZ-23A型垂直電泳槽電泳槽（北京市六一儀器廠），TGL16M型高速冷凍離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司），BX7200HP型超聲波清洗器（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）。

鐵棒錘種子于2017年10月收集于甘南州合作市鐵棒錘種植基地，伏毛鐵棒錘種子于2017年10月收集于甘肅省臨夏回族自治州和政藥用植物園，經(jīng)杜弢教授鑒定，分別為鐵棒錘Aconitum pendulum Busch.和伏毛鐵棒錘Aconitum flavum Hand. Mazz.的種子。三羥甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、甲叉雙丙烯酰胺（Arcy/Bis）、四甲基乙二胺（TEMED）、巰基乙醇、溴酚藍(lán)、甘油、冰醋酸、丙烯酰胺、考馬斯亮藍(lán)G250，天津市大茂化學(xué)試劑廠;過硫酸銨（APS），煙臺(tái)市雙雙化工有限公司。

2? 方法與結(jié)果

2.1? 溶液配制

2.1.1? 濃縮膠緩沖液

精密稱取6 g Tris，加入約60 mL蒸餾水，用1 mol/L鹽酸調(diào)pH值至6.8，蒸餾水定容至100 mL容量瓶中，搖勻，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2? 分離膠緩沖液

精密稱取18.15 g Tris，加入約60 mL蒸餾水，用1 mol/L鹽酸調(diào)pH值至8.8，蒸餾水定容至100 mL容量瓶中，搖勻，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3? 樣品緩沖液

精密吸取濃縮膠緩沖液1.0 mL、50%甘油0.8 mL、10%SDS 1.6 mL、TEMED 0.4 mL、0.05%溴酚藍(lán)0.2 mL、蒸餾水4.0 mL于試管中，搖勻，備用。

2.1.4? 電極緩沖液

精密稱取Tris 3.03 g、甘氨酸14.4 g、SDS 1.0 g，溶入900 mL蒸餾水，定容至1000 mL容量瓶中，搖勻，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.5? 10%、12%、15%分離膠溶液

按表1順序加入試劑，立即混勻，備用。

2.5? 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

2.5.1? 考馬斯亮藍(lán)溶液制備

精密稱取100 mg考馬斯亮藍(lán)G250，溶于90%乙醇50 mL中，加入85%（W/V）磷酸100 mL，再用蒸餾水定容到1 L容量瓶中，搖勻，過夜后過濾，濾液貯藏于棕色瓶中，室溫保存。

2.5.2? 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

精密稱取牛血清蛋白25 mg，加蒸餾水溶解后定容至100 mL容量瓶中，再?gòu)闹形?0 mL，用蒸餾水定容至100 mL容量瓶中，搖勻，置4 ℃冰箱存放，備用。

2.5.3? 供試品溶液制備

精密稱取伏毛鐵棒錘種子粉末0.2 g，按“2.2”項(xiàng)下方法提取蛋白質(zhì)，將提取出的蛋白質(zhì)溶液定容至10 mL容量瓶中，搖勻，作為貯備液。精密吸取0.2 mL貯備液至具塞試管中，加入0.8 mL蒸餾水和5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液，搖勻，備用。

2.5.4? 含量測(cè)定方法

按表2配制濃度為0、20、40、60、80、100 ?g/mL系列對(duì)照品溶液，搖勻，放置2 min，在595 nm波長(zhǎng)處比色測(cè)定，以吸光度（Y）對(duì)牛血清蛋白含量（X）進(jìn)行回歸處理，得回歸方程：Y=0.011 6X+0.016 9（r2=0.999 1）。

2.6? 料液比對(duì)伏毛鐵棒錘種子蛋白質(zhì)電泳的影響

采用巰基乙醇法提取伏毛鐵棒錘種子蛋白質(zhì)，料液比分別設(shè)為1∶10、2∶10、3∶10、1∶15、1∶20、1∶25，電泳結(jié)果見圖2。

2.7? 上樣量對(duì)伏毛鐵棒錘種子蛋白質(zhì)電泳的影響

采用巰基乙醇法提取伏毛鐵棒錘種子蛋白質(zhì)，吸取蛋白質(zhì)提取液40 ?L，用樣品緩沖液稀釋3～12倍，電泳結(jié)果見圖3。

2.8? 鐵棒錘種質(zhì)鑒定

采用巰基乙醇法、15%分離膠、1∶10料液比、蛋白質(zhì)提取液稀釋5倍上樣量進(jìn)行鐵棒錘和伏毛鐵棒錘種子蛋白質(zhì)電泳圖譜比較，結(jié)果見圖4。

由圖4可以看出，鐵棒錘和伏毛鐵棒錘種子蛋白質(zhì)電泳譜帶在著色度和位置上存在差異：伏毛鐵棒錘種子蛋白質(zhì)電泳譜帶較鐵棒錘清晰，泳道背景較深;伏毛鐵棒錘種子蛋白質(zhì)在電泳第二段中間多了一條帶，鐵棒錘種子蛋白質(zhì)電泳在電泳第二段與第三段中間多了一條帶（圖中箭頭所示）。因此，可根據(jù)這2條特征譜帶鑒別鐵棒錘和伏毛鐵棒錘種子。

3? 討論

本試驗(yàn)對(duì)溶液配制時(shí)間及貯存溫度要求較高，如SDS需要在室溫條件下保存，其他配制溶液需在4 ℃冰箱保存，10%APS則需現(xiàn)配現(xiàn)用，所有試劑配制后貯存時(shí)間超過1個(gè)月則嚴(yán)重影響電泳圖譜效果，故需嚴(yán)格控制所配溶液使用時(shí)間。

蛋白質(zhì)電泳圖譜清晰程度和譜帶分離效果與分離膠和濃縮膠有一定關(guān)系，如分離膠凝固不完全則譜帶分離不清晰，濃縮膠凝固不完全則梳子很難取出，點(diǎn)樣困難，進(jìn)而影響譜帶分離，故在制膠過程中需保留足夠時(shí)間凝膠，再進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

6種提取方法所得伏毛鐵棒錘種子蛋白質(zhì)電泳結(jié)果顯示，巰基乙醇法和丙酮沉淀法提取的伏毛鐵棒錘種子蛋白質(zhì)電泳圖譜效果好，SDS-PAGE電泳譜帶數(shù)最多、最清晰，其譜帶數(shù)為14條，但丙酮沉淀法由于沉淀種子蛋白質(zhì)的量較大，在上樣時(shí)需要稀釋次數(shù)多，步驟較巰基乙醇法繁瑣，故最適宜的蛋白質(zhì)提取方法為巰基乙醇法。

電泳相關(guān)因素對(duì)伏毛鐵棒錘種子蛋白質(zhì)電泳效果影響的研究結(jié)果表明，不同料液比、上樣量及分離膠濃度對(duì)種子蛋白質(zhì)電泳圖譜的影響很大。在種子量保持不變情況下，提取液太少或太多都會(huì)影響譜帶的分離及清晰度;提取液稀釋倍數(shù)太少或太多也會(huì)影響譜帶的分離及清晰度;高濃度分離膠較低濃度分離膠更有利于種子蛋白質(zhì)的分離。

鐵棒錘和伏毛鐵棒錘種子蛋白質(zhì)電泳圖譜結(jié)果表明，二者種子蛋白質(zhì)電泳譜帶在位置和著色度方面存在差異，可根據(jù)存在的特征譜帶鑒別鐵棒錘和伏毛鐵棒錘種子。

綜上所述，本試驗(yàn)建立的SDS-PAGE電泳方法經(jīng)濟(jì)、適用、可行，可用于鐵棒錘種子純度檢測(cè)及種質(zhì)鑒定。本研究結(jié)果對(duì)鐵棒錘種質(zhì)資源的保護(hù)、評(píng)價(jià)、種子鑒定、純度測(cè)定及育種具有重要意義。

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（收稿日期：2018-07-27）

（修回日期：2018-08-13;編輯：陳靜）