童俊 毛靜 董艷芳

摘要：利用SRAP分子標(biāo)記對40份鳶尾屬種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳特性及親緣關(guān)系的分析研究，從170個(gè)SRAP隨機(jī)引物中篩選出條帶清晰、多態(tài)性高、重復(fù)性好且穩(wěn)定性強(qiáng)的引物10個(gè)，共檢測到168個(gè)位點(diǎn)且全部為多態(tài)位點(diǎn)，多態(tài)性條帶比例為100%，表明供試材料具有豐富的遺傳多態(tài)性。各種質(zhì)之間的DICE遺傳相似系數(shù)在0.067～0.740，平均相似系數(shù)為0.281。UPGMA聚類分析結(jié)果顯示，當(dāng)遺傳系數(shù)為0.265時(shí)，可將供試材料分為7個(gè)類群。其中，19份德國鳶尾品種聚到一起，扁竹蘭、喜鹽鳶尾、德國鳶尾‘Queen分別各自聚為一類，上海引種的馬藺和寧夏引種的馬藺聚為一類，而內(nèi)蒙古馬藺則和路易斯安那鳶尾聚到一起，西伯利亞鳶尾、花菖蒲、黃菖蒲和3個(gè)德國鳶尾品種聚為一類，主坐標(biāo)分析所反映的關(guān)系和UPGMA聚類圖相似。

關(guān)鍵詞：鳶尾屬;SRAP;遺傳多樣性;親緣關(guān)系

中圖分類號：S682.1+9? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）04-0088-05

Abstract： Sequence-related amplified polymorphism （SRAP） was used to detect the genetic diversity among 40 Iris L. materials. 10 primers which could produce clear， polymorphic and steady bands， screened out of 170 random primers， which were used and produced 168 bands totally. All of bands were polymorphic（100%）， which indicated that the genetic diversity of Iris L. was rich. The genetic similarity coefficient among the accessions ranged from 0.067 to 0.740， and the average was 0.281. At the point of the similarity coefficient 0.265， all the accessions might be separated into seven groups. 19 accessions of Iris germanica were brought together. Iris confusa Sealy， Iris halophila and Iris germanica ‘Queen were classified separately. Iris lactea Pall. var. chinensis from Shanghai and Ningxia were lumped into the same category， while Iris lactea Pall. var. chinensis from Inner Mongolian and Iris louisiana were lumped together. Iris sibirica， Iris ensata， Iris pseudacorus and three accessions of Iris germanica were lumped into the same category. The results of principal coordinates showed similarity to the UPGMA dendrogram.

Key words： Iris L.; SRAP; genetic diversity; relationship

鳶尾是世界上著名的宿根花卉，品種繁多，葉片優(yōu)美，花型多樣，花色艷麗，花期較長，具有“宿根皇后”的美譽(yù)。鳶尾既可觀花又可觀葉的雙重價(jià)值可廣泛用于園林綠化、盆栽及切花等。鳶尾屬是鳶尾科中最大的一個(gè)屬，全世界鳶尾野生種約280種，中國約有60個(gè)種、13個(gè)變種及5個(gè)變型，主要分布于西北、西南及東北等地[1，2]。因受到數(shù)量與觀賞性的制約，這些原種在世界各地園林中用于栽培觀賞的卻不多，真正在園林中廣泛應(yīng)用的是鳶尾園藝品種。目前鳶尾園藝類群包括根莖類無髯鳶尾、根莖類有髯鳶尾和球根鳶尾。其中球根鳶尾一般用于切花生產(chǎn)，在園林中較為少見。有髯鳶尾花型和花色最為豐富，是歐美園林中最為盛行的一類鳶尾。而無髯鳶尾生態(tài)類型一般為濕生或中生型，適應(yīng)性相對較廣，隨著現(xiàn)代育種工作的開展，鳶尾品種也日漸豐富，逐漸受到人們的青睞，其中以西伯利亞鳶尾、日本鳶尾和路易斯安那鳶尾等最為著名[3]。

國內(nèi)外一直在積極開展鳶尾屬植物系統(tǒng)分類學(xué)、細(xì)胞發(fā)育學(xué)、繁殖生物學(xué)、分子生物學(xué)及植物化學(xué)等多方面的研究，采用分子標(biāo)記和序列分析等手段分析鳶尾屬植物的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)與種類親緣關(guān)系也是現(xiàn)代鳶尾屬植物研究的新焦點(diǎn)。牟少華等[4]對中國鳶尾屬植物的地理分布、種質(zhì)資源保存狀況及園林應(yīng)用情況進(jìn)行了概述，并提出了今后研究的4個(gè)主要方向。張敏等[5]對鳶尾屬國內(nèi)分布的25個(gè)野生鳶尾種（變型、變種和居群）和6個(gè)國外分布種的37份材料進(jìn)行了遺傳分析，利用ISSR分子標(biāo)記對德國鳶尾種內(nèi)部分的栽培品種間進(jìn)行了遺傳分析檢測，得到的多態(tài)性位點(diǎn)百分率為99.7%。

SRAP技術(shù)由于多態(tài)性好，穩(wěn)定重復(fù)性好，操作簡便，廣泛運(yùn)用于遺傳多樣性、遺傳穩(wěn)定性和遺傳分化及親緣關(guān)系等[6-9]，此前SRAP標(biāo)記僅見于對鳶尾屬植物中新疆喜鹽鳶尾的研究[10]。本試驗(yàn)利用SRAP分子標(biāo)記對武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林業(yè)果樹研究所收集的德國鳶尾、路易斯安那鳶尾、西伯利亞鳶尾、日本鳶尾花菖蒲的一些栽培品種和國內(nèi)的部分鳶尾屬野生資源開展多樣性評價(jià)及親緣關(guān)系的分析，以期為鳶尾屬植物的遺傳改良和種質(zhì)創(chuàng)新工作提供科學(xué)指導(dǎo)和理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試鳶尾屬材料共40份（表1），主要是從北京、南京、上海及荷蘭等地引進(jìn)的鳶尾屬良種，包括德國鳶尾、路易斯安那鳶尾、西伯利亞鳶尾、日本鳶尾花菖蒲的一些栽培品種和國內(nèi)的部分鳶尾屬野生資源。全部材料種植于武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林業(yè)果樹研究所武湖科技園鳶尾資源圃內(nèi)。

1.2? DNA提取

植物總DNA提取以鳶尾嫩葉為材料，從同一供試種質(zhì)的不同單株上摘取3 g幼嫩葉片混合，洗凈晾干剪碎混合后于液氮中研磨，采用改良CTAB法提取葉片總DNA[11]?？侱NA經(jīng)RNaseA酶解純化后，用等體積的氯仿和異戊醇（體積比為24∶1）混合液抽提。用無水乙醇沉淀后溶于TE，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的分子質(zhì)量并根據(jù)熒光強(qiáng)度確定DNA濃度，將DNA濃度調(diào)到20 ng/μL待用。

1.3? SRAP檢測

選取葉片纖維發(fā)達(dá)程度不同的鳶尾材料3份，從170對SRAP引物中篩選出條帶清晰、多態(tài)性高、重復(fù)性好且穩(wěn)定性強(qiáng)的引物10個(gè)，引物均由英駿生物技術(shù)有限公司合成（引物序列見表2）。Taq DNA聚合酶購自Thermo Scientific公司。在對鳶尾屬植物SRAP分析及PCR擴(kuò)增體系優(yōu)化后，確定反應(yīng)總體積為20 μL，其中Taq DNA聚合酶1 U、10×PCR Buffer 2 μL、1.5 mmol/L的氯化鎂、0.2 mmol/L dNTP、0.25 μmol/L上游引物、0.25 μmol/L下游引物、20 ng模板DNA，其余用無菌水補(bǔ)充。

SRAP-PCR采用復(fù)性變溫法，開始95 ℃變性3 min，反應(yīng)前7個(gè)循環(huán)94 ℃ 1 min，35 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min條件下運(yùn)行，之后37個(gè)循環(huán)為94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循環(huán)結(jié)束后，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠中電泳，85 V電壓，電泳100 min，溴化乙錠染色后在凝膠成像儀上觀察并照相記錄。

1.4? 數(shù)據(jù)分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳位置在凝膠的某個(gè)相同遷移率位置上有DNA條帶記為1，無DNA條帶記為0。利用NTSYS-PC軟件計(jì)算種質(zhì)間DICE遺傳相似系數(shù)，采用SHAN程序中的UPGMA法進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建聚類圖。采用DCENTER程序?qū)ο嗨葡禂?shù)矩陣進(jìn)行轉(zhuǎn)換，再用EIGEN程序進(jìn)行主坐標(biāo)分析得出二維圖。

2? 結(jié)果與分析

2.1? SRAP擴(kuò)增多態(tài)性分析

由表2可知，10個(gè)SRAP隨機(jī)引物在供試材料中共擴(kuò)增出168條帶，全部條帶均為多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶比例為100%，說明供試鳶尾屬材料之間具有豐富的遺傳多態(tài)性。各引物擴(kuò)增的DNA帶數(shù)在13～21條，平均每個(gè)引物擴(kuò)增條帶數(shù)和檢測的SRAP多態(tài)性的平均數(shù)都為16.8，說明供試鳶尾屬植物間的異質(zhì)性較高，遺傳基礎(chǔ)差異較大。部分引物擴(kuò)增出的基因組DNA指紋圖譜見圖1。

2.2? 遺傳多樣性分析

基于SRAP分子標(biāo)記的40份鳶尾種質(zhì)的DICE相似系數(shù)介于0.067～0.740，平均相似系數(shù)為0.281。其中，德國鳶尾‘Tiny Charm（材料11）和引種自寧夏馬藺3號（材料40）的相似系數(shù)最小，為0.067，表明兩者親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，前者為有髯鳶尾，后者為無髯鳶尾。而花菖蒲3號和花菖蒲4號（分別為材料37和材料38）的相似系數(shù)最大，為0.740，表明這兩個(gè)品種親緣關(guān)系最近，遺傳相似程度最高。

2.3? 聚類分析

用NTSYS-PC軟件對40份鳶尾種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析并構(gòu)建出分子系統(tǒng)樹（圖2），從聚類圖上可以反映出物種間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。為了便于分析，在聚類圖的遺傳距離0.265處劃結(jié)合線，將供試鳶尾屬的40份材料劃分為7個(gè)類群。其中Ⅰ群有19份材料，全部為須毛狀附屬物亞屬的德國鳶尾。Ⅱ群由無附屬物亞屬的扁竹蘭單獨(dú)聚為一類。Ⅲ群有10份材料，包括西伯利亞鳶尾、花菖蒲、黃菖蒲和3個(gè)德國鳶尾品種。Ⅳ群由上海引種的馬藺和寧夏引種的馬藺聚為一類。Ⅴ群由喜鹽鳶尾單獨(dú)聚為一類。Ⅵ群由路易斯安那鳶尾和內(nèi)蒙古引種的馬藺聚為一類。Ⅶ群由德國鳶尾‘Queen單獨(dú)聚為一類。

2.4? 主坐標(biāo)分析

為了更好地反映材料間的親緣關(guān)系，進(jìn)行主坐標(biāo)分析，如圖3所示。主坐標(biāo)二維圖所反映的關(guān)系和UPGMA聚類圖的基本相似。以橫坐標(biāo)軸-0.00處將圖3分為兩半，左邊全部為德國鳶尾（對應(yīng)圖2的Ⅰ群），其中中高生德國鳶尾品種分布在左下部，矮生德國鳶尾品種分布在左上部。路易斯安那鳶尾和內(nèi)蒙古引種的馬藺集中分布在右下角（對應(yīng)圖2的Ⅵ群），其他西伯利亞鳶尾和花菖蒲分布在右上部（對應(yīng)圖2的Ⅲ群）。扁竹蘭、兩個(gè)馬藺、喜鹽鳶尾和德國鳶尾‘Queen分布在中間（分別對應(yīng)圖2的Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ群）。

3? 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)的40份材料包括德國鳶尾、路易斯安那鳶尾、西伯利亞鳶尾、日本鳶尾的一些栽培品種和國內(nèi)的部分鳶尾屬野生資源。其中，有髯鳶尾原產(chǎn)歐洲中部和南部地區(qū)，主要是由有髯鳶尾亞屬有髯鳶尾組的原種雜交獲得，其品種異常豐富，一般認(rèn)為德國鳶尾是有髯鳶尾重要雜交親本之一。西伯利亞鳶尾原產(chǎn)中歐和亞洲，是所有鳶尾中適應(yīng)性最廣和抗病蟲害能力最強(qiáng)的一個(gè)類群。日本鳶尾又常稱為花菖蒲，是指原產(chǎn)于日本，由玉蟬花雜交選育所獲得的一個(gè)鳶尾類群。路易斯安那鳶尾是對無髯鳶尾亞屬路易斯安那鳶尾系雜交品種的統(tǒng)稱，該系大部分原種均原產(chǎn)自美國路易斯安那地區(qū)，故得此名。10個(gè)有效引物共檢測到168個(gè)位點(diǎn)且全部為多態(tài)位點(diǎn)，多態(tài)性條帶比例為100%。SRAP分子標(biāo)記本身具有多態(tài)性高的特點(diǎn)，這個(gè)結(jié)果與童俊等[12]利用ISSR分子標(biāo)記對34個(gè)鳶尾屬園藝品種開展遺傳多樣性研究檢測得到的多態(tài)性位點(diǎn)百分率（100%）結(jié)果一致，從而表明SRAP和ISSR兩種標(biāo)記技術(shù)對鳶尾屬種質(zhì)資源的遺傳多樣性的分析具有較高的一致性，也進(jìn)一步證實(shí)了供試鳶尾種質(zhì)資源具有較高的遺傳多樣性。

依據(jù)10個(gè)有效引物所產(chǎn)生的168個(gè)SRAP標(biāo)記為表征性狀所建立的鳶尾40份種質(zhì)資源UPGMA聚類圖，將鴦尾40份種質(zhì)資源劃歸為7個(gè)類群，其中Ⅰ群有19份材料，全部為須毛狀附屬物亞屬的德國鳶尾。Ⅱ群由無附屬物亞屬的扁竹蘭單獨(dú)聚為一類。Ⅲ群有10份材料，包括西伯利亞鳶尾、花菖蒲、黃菖蒲和3個(gè)德國鳶尾品種。Ⅳ群由上海引種的馬藺和寧夏引種的馬藺聚為一類。Ⅴ群由喜鹽鳶尾單獨(dú)聚為一類。Ⅵ群由路易斯安那鳶尾和內(nèi)蒙古引種的馬藺聚為一類。Ⅶ群由德國鳶尾‘Queen單獨(dú)聚為一類。40份材料的平均相似系數(shù)為0.281。其中，德國鳶尾‘Tiny Charm和寧夏引種的馬藺相似系數(shù)最小，表明兩者親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。而花菖蒲3號和花菖蒲4號的相似系數(shù)最大，表明這兩個(gè)品種親緣關(guān)系最近?；ㄝ牌?號和花菖蒲4號均為花菖蒲的栽培品種，僅花色不同。

遺傳多樣性和種質(zhì)間親緣關(guān)系的研究，不僅與種質(zhì)資源的收集、保存和更新密切相關(guān)，而且是種質(zhì)資源創(chuàng)新和品種改良的基礎(chǔ)。物種的遺傳多樣性程度是物種長期進(jìn)化的產(chǎn)物，物種遺傳多樣性越高，表明種質(zhì)資源在DNA分子水平存在差異越大，對環(huán)境變化的適應(yīng)能力就越強(qiáng)，越容易擴(kuò)展其分布范圍和開拓新的環(huán)境，可供進(jìn)一步選擇、保存和利用的空間就越大。種質(zhì)間的親緣關(guān)系較近，說明其來源于共同的祖先種的可能性大，在DNA分子水平的差異較小，種質(zhì)間含有的相同基因的概率高，可供選擇和利用的余地就小。由此，本研究利用SRAP分子標(biāo)記的方法，在分子水平揭示所收集的鳶尾屬種質(zhì)資源的親緣關(guān)系，結(jié)合形態(tài)特征和園藝特性，就可以進(jìn)一步在遺傳多樣性高的群體篩選和保留種質(zhì)，同時(shí)為進(jìn)一步新品種選育提供優(yōu)質(zhì)的親本材料，提高保存和利用種質(zhì)的效率。

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