張冬先，曾柏瑞，何永旺，楊根夢(mèng)，曾曉鋒，李 楨

甲基苯丙胺(methamphetamine,METH)是苯丙胺類(lèi)興奮劑，是目前最流行的新型合成毒品之一，具有明顯的精神依賴(lài)性、高復(fù)吸率和神經(jīng)毒性等特點(diǎn)[1]，長(zhǎng)期濫用對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)可產(chǎn)生顯著的毒性作用，并對(duì)濫用者的身心造成嚴(yán)重?fù)p害。HIV-Tat蛋白是HIV-1基因編碼的內(nèi)源性蛋白分子，稱(chēng)為反式轉(zhuǎn)錄激活因子，能促進(jìn)HIV基因組轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的激活。大量研究表明，METH與HIV-Tat蛋白能協(xié)同誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用[2-3]，且METH和HIV-Tat蛋白可對(duì)血腦屏障產(chǎn)生嚴(yán)重影響[4-5]。血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)是由腦組織內(nèi)連續(xù)微小血管內(nèi)皮細(xì)胞及其之間的緊密連接蛋白、周細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞腳板共同圍成的神經(jīng)膠質(zhì)膜等構(gòu)成[6]。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體-1(glucose transporter 1，GLUT1)是轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖通過(guò)BBB的重要轉(zhuǎn)運(yùn)體之一，其以多種結(jié)構(gòu)形式廣泛存在于多種細(xì)胞。GLUT1的表達(dá)情況與大腦中葡萄糖代謝轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)，某些疾病引起的病理狀態(tài)往往伴隨著GLUT1表達(dá)及其功能改變[6]，而METH和HIV-Tat蛋白對(duì)血腦屏障的影響是否具有協(xié)同作用及GLUT1是否參與上述作用的研究報(bào)道較少。本研究旨在探討METH和HIV-Tat蛋白誘導(dǎo)血腦屏障通透性改變過(guò)程中是否具有協(xié)同作用，且GLUT1是否參與協(xié)同作用的調(diào)節(jié)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑雄性SD大鼠(體質(zhì)量230～270 g)由昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。甲基苯丙胺(純度>95%)由中國(guó)藥品生物制品鑒定所提供，用生理鹽水溶解成終濃度為2.5 g·L-1備用。HIV-Tat蛋白購(gòu)自以色列PROSPEC公司，每支10 μg，用生理鹽水溶解成終濃度為0.1 mg·L-1備用。伊文思藍(lán)顆粒，每瓶1 g，購(gòu)自昆明諾貝生物科技有限公司，用生理鹽水溶解成終濃度為2 mg·L-1備用。一抗：兔抗-GLUT1購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotech公司；二抗：抗-鼠/兔均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司試劑。

1.2 方法

1.2.1 BBB損傷動(dòng)物模型的建立40只雄性SD大鼠隨機(jī)分成4組，對(duì)照組：每日腹腔注射生理鹽水10 mL·kg-1；METH組：每日腹腔注射METH 10 mg·kg-1；HIV-Tat蛋白組：每日尾靜脈注射HIV-Tat蛋白400 ng·kg-1；METH+HIV-Tat蛋白組：每日同時(shí)注射METH和HIV-Tat蛋白。持續(xù)給藥7 d。

1.2.2 伊文思藍(lán)Evans blue，EB注射和含量的測(cè)定麻醉藥物灌注取腦組織之前30 min，尾靜脈注射伊文斯藍(lán)(Evans blue，EB)(2 mL·kg-1)溶液，并通過(guò)觀察大鼠全身皮膚、黏膜、眼部等部位變?yōu)樗{(lán)綠色后，證實(shí)EB溶液成功注入。由于EB的分子量大小與白蛋白相接近，EB進(jìn)入血漿后可與白蛋白結(jié)合，因此EB常被用作BBB破壞的示蹤劑。灌注后所取的腦組織用玻璃勻漿器勻漿腦組織并加入3 mL甲酰胺溶液，54 ℃恒溫水浴箱中孵育36～48 h，然后離心15～20 min，取上清液測(cè)吸光度(λ=620 nm)，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算腦組織內(nèi)EB的含量。

1.2.3 免疫組化將腦組織切片脫蠟水化，用3% H2O2室溫滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶5～10 min，用PBS洗3次，每次5 min。然后用山羊血清封閉30 min。加入兔抗-GLUT1抗體(1∶200)，4 ℃冰箱過(guò)夜。第二天切片室溫復(fù)蘇1 h后，加入兔多克隆二抗，37 ℃條件下孵育30 min。然后進(jìn)行DAB 顯色、蘇木素復(fù)染、梯度酒精脫水、二甲苯透明等步驟，最后用中性樹(shù)膠封片。

1.2.4 Western Blotting取各組適量腦組織加入蛋白裂解液，在超聲破碎儀上破碎腦組織后于4 ℃、14 000 r·min-1離心10 min后取上清。用BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。隨后取適量蛋白混合5×蛋白上樣緩沖液，在沸水浴中煮10 min進(jìn)行蛋白質(zhì)變性。進(jìn)行SDS PAGE電泳，并用半干電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF膜,再用5%的脫脂奶粉封閉1 h，封口孵育一抗(1∶1 000)于4 ℃冰箱過(guò)夜。第二天用TBST洗膜10 min× 3 次，加二抗(1∶5 000 )室溫孵育 2 h，用TBST洗膜10 min，3次后ECL顯色液激發(fā)化學(xué)發(fā)光，曝光。應(yīng)用Image J軟件分析灰度值。

2 結(jié)果

2.1 腦組織EB含量結(jié)果正常對(duì)照組EB含量為(0.27±0.05) μg·g-1，METH組為(1.16±0.06) μg·g-1，HIV-Tat蛋白組為(0.57±0.05) μg·g-1，METH+HIV-Tat蛋白組為(3.20±0.05) μg·g-1。與對(duì)照組相比，METH組、HIV-Tat蛋白組和METH+HIV-Tat蛋白組EB含量明顯升高(P<0.05)。與METH+HIV-Tat蛋白組相比，METH組和HIV-Tat蛋白組EB含量明顯減少(P<0.05)。

2.2 GLUT1蛋白免疫組化的結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示：GLUT1對(duì)照組、METH組、HIV-Tat蛋白組和METH+HIV-Tat蛋白組均有不同程度的表達(dá)。陽(yáng)性結(jié)果表現(xiàn)為血管壁呈棕黃色，GLUT1定位于包膜上。與對(duì)照組比較，METH組、HIV-Tat蛋白組和METH+HIV-Tat蛋白組陽(yáng)性信號(hào)均不同程度降低；與METH組和HIV-Tat蛋白組相比，METH+HIV-Tat蛋白組表達(dá)GLUT1水平明顯降低。見(jiàn)圖1。

A：對(duì)照組；B：METH組；C：HIV-Tat蛋白組；D：METH+HIV-Tat蛋白組。各組表達(dá)GLUT1水平逐漸降低。圖1 GLUT1蛋白免疫組化結(jié)果(DAB，×200)

2.2.1 GLUT1陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值檢測(cè)各組GLUT1表達(dá)的平均光密度值結(jié)果如下：對(duì)照組平均光密度值為0.925 2±0.119 2、METH組為0.533 1±0.037 9、HIV-Tat蛋白組為0.870 4±0.058 3、METH+HIV-Tat蛋白組為0.336 0±0.042 2。與對(duì)照組相比，METH組、HIV-Tat蛋白組和METH+HIV-Tat蛋白組表達(dá)GLUT1陽(yáng)性細(xì)胞的光密度值降低(P<0.05)，與METH+HIV-Tat蛋白組相比，METH組和HIV-Tat蛋白組表達(dá)水平有升高(P<0.05)。

2.3 GLUT1蛋白表達(dá)的WB結(jié)果與對(duì)照組相比，METH組、HIV-Tat蛋白組和METH+HIV-Tat蛋白組GLUT1表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與METH+HIV-Tat蛋白組相比，METH組和HIV-Tat蛋白組表達(dá)GLUT1水平有所升高(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

A：GLUT1蛋白的WB表達(dá)結(jié)果；B：GLUT1/β-actin的表達(dá)情況。①與對(duì)照組比較，P<0.05；②與METH+HIV-Tat蛋白組相比，P<0.05。圖2 GLUT1的表達(dá)情況

3 討論

METH對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有較強(qiáng)烈的神經(jīng)毒性。以往研究認(rèn)為，METH系陽(yáng)離子脂溶性分子，易通過(guò)BBB直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)導(dǎo)致神經(jīng)毒性，且此過(guò)程中METH并不破壞BBB的結(jié)構(gòu)與功能。然而，最近研究表明，METH可以改變BBB內(nèi)緊密連接蛋白的正常表達(dá)水平，降低腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain microvascular endothelial cells，BMVEC)跨內(nèi)皮的阻抗作用，同時(shí)增強(qiáng)免疫細(xì)胞跨內(nèi)皮層遷移的運(yùn)動(dòng)能力[7]。此外，METH能夠通過(guò)減少緊密連接蛋白的表達(dá)和增加反應(yīng)活性氧化產(chǎn)物來(lái)提高BMVEC的通透性[4，8]。而本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，METH組大鼠BBB對(duì)EB通透性明顯升高(P<0.05)，說(shuō)明METH可改變BBB的通透性。而且，HIV-Tat組大鼠BBB對(duì)EB的通透性增加。說(shuō)明HIV-Tat蛋白可改變BBB的通透性。

METH的濫用增加了HIV感染的風(fēng)險(xiǎn)，并促進(jìn)HIV感染所致的神經(jīng)毒性[2]。HIV-Tat蛋白同樣可以加重METH的神經(jīng)毒性作用[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，HIV-Tat組大鼠BBB對(duì)EB的通透性增加，說(shuō)明HIV-Tat蛋白可改變BBB的通透性。大量研究表明，METH與HIV-Tat蛋白不僅具有相互作用，兩者還具有顯著的協(xié)同神經(jīng)毒性作用[2,5,10]。本課題組之前研究已證實(shí)METH與 HIV-Tat 蛋白可協(xié)同誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，可能與其改變血腦屏障通透性作用有關(guān)[11]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，HIV-Tat蛋白能改變緊密連接蛋白的表達(dá)水平以及結(jié)構(gòu)功能[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，分別與對(duì)照組、METH組和HIV-Tat蛋白相比，METH+HIV-Tat蛋白組腦組織中EB含量明顯升高(P<0.01)，說(shuō)明METH與HIV-Tat蛋白可協(xié)同誘導(dǎo)BBB通透性的改變。

GLUT1可調(diào)控多種組織細(xì)胞尤其是腦組織細(xì)胞的血糖水平，同時(shí)也是決定腦組織葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)及其代謝的關(guān)鍵因素。GLUT1在BBB毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中高度特異性表達(dá)。在正常情況下腦組織是需要完全依賴(lài)葡萄糖作為供能物質(zhì)，因此葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)在腦能量代謝過(guò)程中顯得尤其重要[6]。METH和HIV-Tat不僅對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有毒性作用，而且還能協(xié)同改變BBB的通透性，此外，本研究發(fā)現(xiàn)GLUT1在此過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。本研究免疫組化和WB結(jié)果均發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，METH組，HIV-Tat組和METH+HIV-Tat組表達(dá)GLUT1水平不同程度降低，說(shuō)明GLUT1在METH與HIV-Tat蛋白協(xié)同誘導(dǎo)大鼠血腦屏障通透性改變中起重要作用。