魏 娜，張飛龍

(西藏農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)研究所， 西藏 拉薩 850032)

黃曲霉毒素主要是黃曲霉菌和寄生曲霉菌的代謝產(chǎn)物，毒性是氰化鉀的 10 倍，是人類癌癥的一個(gè)重要的致癌源，被世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機(jī)構(gòu)定為Ⅰ類致癌物[1]。黃曲霉毒素廣泛存在于糧油農(nóng)產(chǎn)品及其制品中，至今已分離出的黃曲霉毒素及其衍生物有20多種，而黃曲霉毒素M1作為其中的一種，主要存在于牛乳中[2-3]。 西藏酥油是從高原地區(qū)牦牛牛奶中提煉出來(lái)的油脂產(chǎn)品，是西藏高原地區(qū)牧民攝入脂肪的主要膳食途徑之一[4-5]。酥油主要含有脂肪、水分及少量蛋白質(zhì)，其中水分含量高達(dá)15 %左右，豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和較高的水分含量為微生物的滋生與繁殖創(chuàng)造了非 常適宜的環(huán)境條件，若儲(chǔ)藏條件不佳，便會(huì)導(dǎo)致酥油中霉菌的大量繁殖，產(chǎn)生真菌毒素，嚴(yán)重影響酥油品質(zhì)及其安全性[6]。劉曉棠、達(dá)娃卓瑪、王秋玲等對(duì)西藏酥油中微生物的污染進(jìn)行了評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)西藏地區(qū)酥油樣品霉菌檢出率為90 %以上[7-9]。由于儀器設(shè)備及檢測(cè)技術(shù)的限制，目前鮮有對(duì)西藏酥油中真菌毒素含量研究報(bào)道。黃曲霉毒素最常用的檢測(cè)方法是高效液相色譜分析法，雖然精確度高，但設(shè)備昂貴、操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、檢測(cè)成本高。時(shí)間分辨免疫熒光免疫層析(time-resolved fluorescence immunochromatography，TRFIA)，是近些年來(lái)得到發(fā)展應(yīng)用的一種免疫分析技術(shù)，具有靈敏度高、檢測(cè)速度快、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)目前已在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域得到應(yīng)用[10-14]。因此本研究采用時(shí)間分辨熒光免疫分析儀測(cè)定酥油中黃曲霉毒素M1含量，以期為西藏酥油產(chǎn)品的質(zhì)量安全、科學(xué)監(jiān)管與防控提供重要檢測(cè)手段。

表1 酥油樣品中精密度與加標(biāo)回收率

1 材料與方法

1.1 檢測(cè)原理

采用競(jìng)爭(zhēng)免疫層析原理定量檢測(cè)乳制品中黃曲霉毒素M1含量：在檢測(cè)試紙條上固化了黃曲霉毒素M1抗原和質(zhì)控抗體；在凍干品中包含有時(shí)間分辨熒光素標(biāo)記的黃曲霉毒素M1抗體和質(zhì)控抗原，當(dāng)在凍干品中加入含有黃曲霉毒素M1的樣品后，時(shí)間分辨熒光素標(biāo)記的黃曲霉毒素M1抗體發(fā)生化學(xué)反應(yīng)生成復(fù)合物，插入試紙條后，該復(fù)合物會(huì)隨樣品層析到T檢測(cè)區(qū)域而不與T線的抗原結(jié)合，樣品黃曲霉毒素M1含量越高，T區(qū)域結(jié)合越弱。凍干品中的質(zhì)控抗原與C線位置的質(zhì)控抗體直接結(jié)合。

1.2 儀器

時(shí)間分辨熒光免疫分析儀、K30加熱器、高效液相色譜儀。

1.3 檢測(cè)方法

前處理。稱取1～2 g樣品(精確到0.001 g，被稱試樣中含黃曲霉毒素AFM1<8 ng)于50 mL離心管，加入8 mL石油醚，待酥油溶解后加入9 mL水和11 mL甲醇，振蕩30 min，將全部液體移至分液漏斗中。加入0.3 g氯化鈉搖動(dòng)溶解，靜置分層后，將下層轉(zhuǎn)移到圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至10 mL以下，用PBS稀釋至30 mL。

時(shí)間分辨熒光免疫層析法。將待測(cè)樣品及檢測(cè)試紙、凍干品回復(fù)至室溫。打開(kāi)樣品杯，加入150 μl待測(cè)樣品，充分溶解、混勻，置加熱器37 ℃溫育，取出檢測(cè)試紙條，插入加熱器上的樣品杯中，孵育6 min后，取出試紙條吸干下端液體，3 min內(nèi)放入時(shí)間分辨熒光免疫分析儀中讀取結(jié)果，當(dāng) AFM1含量過(guò)高，超出檢測(cè)卡的檢測(cè)范圍(2.0 μg/kg)時(shí)，需將樣品進(jìn)行一定比例稀釋后進(jìn)行檢測(cè)。

免疫親和柱凈化-HPLC法。按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素M族的測(cè)定》(GB 5009.24-2016)第二法 高效液相色譜法測(cè)定。C18色譜柱(4.6 mm×150 mm ×5 μm)；進(jìn)樣量50 μl；柱溫40 ℃；流動(dòng)相為乙腈-甲醇(1∶1)和水，梯度洗脫，流速為1.0 mL/min；熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)440 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的準(zhǔn)確度和精密度

根據(jù)黃曲霉毒素定量檢測(cè)卡的定量范圍0～2.0 μg/kg，分別添加 AFM1標(biāo)準(zhǔn)溶液于陰性酥油樣品中，使其在樣品中的最終含量為 0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 μg/kg，并進(jìn)行5次重復(fù)試驗(yàn)。表1可知，該方法測(cè)定不同樣品中AFM1的回收率在 77.6 %～89.6 %之間，樣品的重復(fù)測(cè)定結(jié)果RSD為6.12 %～14.06 %。說(shuō)明該檢測(cè)技術(shù)具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

2.2 黃曲霉毒素時(shí)間分辨熒光免疫層析檢測(cè)實(shí)際樣品與HPLC檢測(cè)結(jié)果比對(duì)

選取5份酥油樣品，分別采用時(shí)間分辨熒光免疫分析法和《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn).食品中黃曲霉毒素M族的測(cè)定》(GB 5009.24-2016，第二法 高效液相色譜法)進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)一步考察驗(yàn)證方法的科學(xué)性和適用性。由表2可知，時(shí)間分辨熒光免疫分析法與免疫親和柱凈化-HPLC法測(cè)定結(jié)果的相對(duì)誤差小于10 %，能滿足酥油產(chǎn)品中黃曲霉毒素M1快速篩查的測(cè)定準(zhǔn)確度的要求。與國(guó)標(biāo)方法免疫親和柱凈化-HPLC法相比，該方法具有操作簡(jiǎn)便、時(shí)間短、靈敏度高、不用接觸毒素標(biāo)準(zhǔn)品、有機(jī)試劑用量少、對(duì)環(huán)境及檢驗(yàn)人員安全性最高等優(yōu)點(diǎn)，適用于企業(yè)和質(zhì)檢機(jī)構(gòu)對(duì)糧油農(nóng)產(chǎn)品中 AFM1進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)篩查。

3 結(jié) 論

本文利用高效液相色譜法和時(shí)間分辨熒光免疫層析法進(jìn)行酥油中黃曲霉毒M1檢測(cè)的對(duì)比研究。采用時(shí)間分辨熒光免疫層析法檢測(cè)其回收率為77.6 %～89.6 %，變異系數(shù)為6.12 %～14.05 %，與 HPLC法相比，檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著性差異，相對(duì)誤差小于12 %。時(shí)間分辨熒光免疫層析法檢測(cè)過(guò)程中避免使用黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品，可以直接讀取檢測(cè)結(jié)果，且所需時(shí)間短，檢測(cè)全過(guò)程控制10 min內(nèi)，儀器便于攜帶，可實(shí)現(xiàn)在農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和超市等現(xiàn)場(chǎng)實(shí)地的快速檢測(cè)，為酥油樣品中黃曲霉毒素的快速檢測(cè)提供了一種新的模式。

表2 時(shí)間分辨熒光免疫層析法與高效液相色譜法檢測(cè)結(jié)果比較