馮帆，楊秀清，閆海冰

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，山西 太谷 030801)

西伯利亞白刺 (NitrariasibiricaPall)，又名小果白刺，為蒺藜科(Zygophylaceae)白刺屬(Nitraria)落葉小灌木[1]，該樹(shù)種根系發(fā)達(dá)，多分枝、生長(zhǎng)快、果實(shí)兼具食用和藥用價(jià)值，枝、葉可作飼料，在我國(guó)西北部與北部地區(qū)的新疆、青海、寧夏、甘肅以及內(nèi)蒙古等地區(qū)的鹽堿地上多有分布，因此被認(rèn)為是鹽堿地生物改良的優(yōu)良經(jīng)濟(jì)型樹(shù)種資源[2,3]。中國(guó)目前17個(gè)省區(qū)都有鹽漬土資源分布，總面積逾5億畝。全球鹽堿地面積也在逐年擴(kuò)大，鹽堿地己成為全球重要的后備土地資源[4]。利用耐鹽堿植物改良土地鹽堿化是提高鹽漬化土地利用效率，并對(duì)土壤起持久改善作用的一項(xiàng)合理途徑。對(duì)西伯利亞白刺進(jìn)行耐鹽機(jī)理研究，可為白刺有效應(yīng)用于鹽堿地改良和維持生態(tài)平衡提供重要依據(jù)，同時(shí)對(duì)白刺經(jīng)濟(jì)價(jià)值的發(fā)揮和擴(kuò)大其資源利用具有重要意義。

關(guān)于白刺耐鹽機(jī)理的研究，楊升等[5]通過(guò)測(cè)定鹽脅迫后西伯利亞白刺幼苗體內(nèi)脯氨酸、可溶性糖、甜菜堿及礦質(zhì)元素(尤其是Na+、K+和 Cl-)含量的變化，從生理角度揭示了這幾種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)白刺耐鹽能力的影響；張麗等[6]通過(guò)人工施鹽的脅迫處理，從生理生化的角度表明白刺在鹽脅迫下膜保護(hù)和修復(fù)能力均顯著提高，體內(nèi)有機(jī)滲透物質(zhì)增加，降低細(xì)胞內(nèi)水勢(shì)，同時(shí)還可以通過(guò)葉片胞內(nèi)的離子區(qū)隔化減少鹽分對(duì)重要細(xì)胞器的損傷；程鐵龍等[7]基于蛋白組學(xué)研究了鹽脅迫后的西伯利亞白刺葉片,共檢測(cè)到71種蛋白質(zhì)的表達(dá)發(fā)生了顯著變化，這些蛋白質(zhì)參與的過(guò)程包括光合作用、碳水化合物和能量代謝，膜運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及氧化還原反應(yīng)等；Chen J等[8]鑒定出鹽脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，得出鹽脅迫下光合作用的降低與參與光反應(yīng)和卡爾文循環(huán)的酶、蛋白下調(diào)有關(guān)的結(jié)論。這些研究在不同水平上很好地揭示了西伯利亞白刺的耐鹽機(jī)制，尤其是鹽脅迫下體內(nèi)蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)表達(dá)規(guī)律的分析將對(duì)西伯利亞白刺耐鹽機(jī)理的認(rèn)識(shí)深入到分子生物學(xué)的水平。但是，僅基于蛋白組學(xué)的研究并不能反映鹽脅迫下白刺其他耐鹽相關(guān)代謝產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)變化，對(duì)西伯利亞白刺耐鹽相關(guān)代謝途徑的認(rèn)識(shí)尚屬空白[9]?；诖x組學(xué)的研究將有助于更深入的了解適應(yīng)脅迫環(huán)境的分子機(jī)制。

鑒于此，本實(shí)驗(yàn)基于代謝組學(xué)的研究分析了西伯利亞白刺鹽脅迫前后差異代謝物種類(lèi)及含量的變化，找到參與脅迫應(yīng)答的代謝途徑，深入揭示其適應(yīng)鹽脅迫的代謝生物學(xué)機(jī)制，為西伯利亞白刺在鹽堿地生物改良中的科學(xué)的資源利用提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源及實(shí)生苗培育

白刺種子采自?xún)?nèi)蒙古巴彥淖爾市磴口縣境內(nèi)烏蘭布和沙漠東北部(海拔1 036 m,N40°32′,E106°28′)白刺產(chǎn)地的野生種。果實(shí)采回后揉搓濾去果汁、果皮，洗凈晾干，置于涼爽、通風(fēng)、干燥條件下貯藏備用。

挑選飽滿種粒于0.5‰KMnO4溶液中避光浸泡2 h，后于200 mg.L-1ABT1號(hào)溶液中預(yù)處理30 min，洗凈后播于16 cm×14 cm規(guī)格裝有純凈濕沙的營(yíng)養(yǎng)缽中，每缽播種70粒，種植深度4 cm，共計(jì)6缽，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)箱設(shè)置光照時(shí)間14 h，光照強(qiáng)度1 200 Lux，溫度27 ℃。試驗(yàn)過(guò)程中澆灌蒸餾水，澆水量為100 mL，每隔3天澆灌一次。

1.2 鹽脅迫處理及取樣

播種12天后種子發(fā)芽率為68.1%，待幼苗生長(zhǎng)50天進(jìn)行脅迫前取樣，此時(shí)6個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽中正常生長(zhǎng)的西伯利亞白刺幼苗共255株。每一營(yíng)養(yǎng)缽中隨機(jī)剪取白刺幼苗葉片100 mg，6缽共計(jì)6次重復(fù)，取下樣品用錫箔紙包裹、編號(hào)，浸泡于液氮7 min后迅速取出置于-80 ℃冰箱備測(cè)。取樣后立即進(jìn)行脅迫處理，用300 mM NaCl溶液澆灌幼苗，每盆澆灌100 mL，每3天澆灌一次。為防止鹽分流失，營(yíng)養(yǎng)缽底部墊有塑料托盤(pán)，澆灌后滲出的溶液重新倒回營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)，同時(shí)定時(shí)記錄白刺的生長(zhǎng)狀況。脅迫后第6天幼苗頂端的嫩葉邊緣出現(xiàn)微黃甚至萎蔫，此時(shí)取脅迫后的樣品，取樣方法與脅迫前一致，對(duì)所取樣品編號(hào)備測(cè)。

1.3 代謝物的提取及檢測(cè)

取樣本25±1 mg于2 mL EP管中，加入300 μL提取液(甲醇∶水=3∶1)，再加入5 μL核糖醇，渦旋30 s后低溫離心15 min(12000 rpm轉(zhuǎn)速)，移取200 μL上清液于1.5 mL EP管中，真空濃縮干燥提取物，向干燥后的代謝物中加入30 μL甲氧胺鹽試劑(甲氧胺鹽酸鹽，溶于吡啶20 mg·mL-1)，混勻后放入烘箱中80 ℃孵育30 min，再向每個(gè)樣品中加入40 μL BSTFA(含有1% TMCS,v/v)，70 ℃孵育1.5 h，冷卻至室溫，加入5 μL FAMEs。使用配有Agilent DB-5MS毛細(xì)管柱的Agilent 7890氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀(30 m×250 μm×0.25 μm,J&W Scientific,Folsom,CA,USA)對(duì)樣品進(jìn)行GC-TOFMS檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

使用ChromaTOF軟件(V 4.3x，LECO)對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分、峰對(duì)齊等分析[10]。在物質(zhì)定性分析時(shí)，使用LECO-Fiehn Rtx5數(shù)據(jù)庫(kù)，包括質(zhì)譜匹配及保留時(shí)間指數(shù)匹配[11]，采用多元變量統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)代謝物進(jìn)行篩選，并找出差異代謝物，利用富集分析和拓?fù)浞治鰧?duì)差異代謝物所在通路進(jìn)行綜合分析，進(jìn)一步確定西伯利亞白刺耐鹽性相關(guān)差異代謝物及耐鹽代謝通路。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫下白刺葉片代謝物改變的應(yīng)答及層次聚類(lèi)分析

鹽脅迫后西伯利亞白刺葉片中鑒定出差異代謝物共108種。除己內(nèi)酰胺和黃烷腺嘌呤衍生物2種代謝物濃度顯著下調(diào)外(下調(diào)濃度分別為3.18倍和4.22倍)，其余106種差異代謝物包括51種氨基酸類(lèi)、22種糖類(lèi)、11種脂肪酸類(lèi)、8種有機(jī)酸類(lèi)、7種醇類(lèi)、5種生物堿以及2種維生素濃度均顯著上調(diào)(上調(diào)范圍在0.54倍和13.80倍之間)。其中上調(diào)濃度最大的代謝物為苯丙氨酸，上調(diào)濃度最小的代謝物為6-羥基己酸二聚物。顯著上調(diào)的前10個(gè)差異代謝物見(jiàn)表(表1)。將已定性的108種差異代謝物進(jìn)行層次聚類(lèi)分析(圖1)可知：層次聚類(lèi)分析將這些代謝物主要分成了A和B兩大類(lèi)，其中A類(lèi)包括生物堿和堿基衍生物，B類(lèi)主要包括大部分氨基酸類(lèi)、糖類(lèi)、脂肪酸類(lèi)、醇類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、生物堿等。

表1 鹽脅迫下西伯利亞白刺葉片中差異代謝物Table 1 Differentially expressed metabolites of Nitraria sibirica Pall under salt stress

注：Peak：定性得到的物質(zhì)名稱(chēng)；Similarity：定性分析中該物質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)中物質(zhì)的匹配程度，取值[0,1000],數(shù)值越高說(shuō)明定性出的物質(zhì)越準(zhǔn)確；Rt：該物質(zhì)的色譜保留時(shí)間；LOG_FOLDCHANGE：該物質(zhì)對(duì)比兩組實(shí)驗(yàn)間倍數(shù)關(guān)系以2為底的對(duì)數(shù)值，正號(hào)表示脅迫后較脅迫前的差異代謝物含量是顯著上調(diào)關(guān)系，數(shù)值越大濃度上調(diào)越多。
Note：Peak：A qualitative description of the substance；Similarity：The matching degree between the substance and the standard substance in the qualitative analysis，The range is 0 to 1000，The higher the value,the more accurate the substance；Rt：The chromatographic retention time of the substance；LOG_FOLDCHANGE：The substance was compared between the two groups of experiments with the logarithm of base 2，The positive sign indicates that the difference of metabolite content after stress is significantly higher than that before stress，The higher the value,the higher the concentration.

圖1 鹽脅迫下西伯利亞白刺差異代謝物聚類(lèi)分析圖Fig.1 Hierarchical clustering analysis of differentially expressed metabolites of Nitraria sibirica Pall under salt stress

2.2 鹽脅迫后西伯利亞白刺差異代謝物的代謝通路分析

鹽脅迫后西伯利亞白刺葉片中濃度上調(diào)的106種差異代謝物經(jīng)過(guò)富集分析和拓?fù)浞治霰蛔⑨尩?6條代謝通路中(圖2)，其中參與到氨基酸生物合成代謝途徑(圖3)和苯丙氨酸代謝途徑(圖4)中的差異代謝物種類(lèi)最多。被注釋到氨基酸生物合成代謝途徑中的與鹽脅迫相關(guān)的差異代謝物有6種，分別為檸康酸、L-亮氨酸、3-異丙基蘋(píng)果酸、L-纈氨酸、L-異亮氨酸、丙酮酸；被注釋到苯丙氨酸代謝途徑中的與鹽脅迫相關(guān)的差異代謝物也有6種，分別為苯丙氨酸、L-半胱氨酸、纈氨酸、賴(lài)氨酸、異亮氨酸、天冬酰胺。乳糖、葡糖糖、木糖、阿洛糖主要參與糖降解、糖異生及半乳糖代謝過(guò)程。參與脂肪酸合成過(guò)程的代謝物主要包括棕櫚酸、硬脂酸和肉豆蔻酸等飽和脂肪酸以及亞麻酸、亞油酸等不飽和脂肪酸。檸檬酸、α-酮戊二酸、蘋(píng)果酸主要參與TCA循環(huán)過(guò)程。此外，其余差異代謝物還參與苯丙類(lèi)生物合成途徑、嘌呤代謝、二羧酸鹽代謝、戊糖和葡聚糖酸酯間轉(zhuǎn)化代謝及氧化磷酸化過(guò)程等。同時(shí)，谷甾醇作為植物固醇的一種重要物質(zhì)，其含量也顯著上調(diào)，有利于維持膜的完整性。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)鑒定到氨基酸類(lèi)差異代謝物共51種。氨基酸是合成結(jié)構(gòu)蛋白與應(yīng)激蛋白的重要小分子物質(zhì)，在植物的生命活動(dòng)中承擔(dān)著極為重要的生理作用[13]。在正常生長(zhǎng)狀態(tài)下，氨基酸、有機(jī)酸的含量往往很低，只有在逆境條件下這些有機(jī)物的含量才會(huì)上升，但他們本身并不會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)造成傷害[14]。Hare等[15]研究了鹽脅迫條件下脯氨酸含量的變化，結(jié)果表明脯氨酸的積累有助于植物抵抗逆境環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鹽脅迫后西伯利亞白刺葉片中51種氨基酸差異代謝物的含量較脅迫前均顯著上調(diào)，其中，脯氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、丙氨酸、絲氨酸、谷氨酸、異亮氨酸等含量的上調(diào)范圍均在2.07倍以上。脯氨酸的合成與降解會(huì)促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、線粒體的氧化還原反應(yīng)及腺苷酸的合成，同時(shí)還可以作為碳、氮及其他細(xì)胞抵抗逆境所需能源物質(zhì)的還原劑，這會(huì)提供給西伯利亞白刺葉片一個(gè)較高的逆境抵抗力，表明氨基酸在西伯利亞白刺體內(nèi)抵抗鹽脅迫、維持穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮了重要的作用。

圖2 鹽脅迫下西伯利亞白刺代謝通路分析氣泡圖Fig.2 Metabolic pathway analysis of Nitraria sibirica Pall under salt stress注：氣泡圖中每一個(gè)氣泡代表一個(gè)代謝通路，氣泡所在橫坐標(biāo)和氣泡大小代表該通路在拓?fù)浞治鲋械挠绊懸蜃?，氣泡越大影響因子越大；氣泡所在縱坐標(biāo)和顏色表示富集分析的P值，顏色越深P值越小，富集程度越顯著。Note：Each bubble represents a metabolic pathway in the bubble map,The abscissa and bubble size represent the influencing factors of the path in topological analysis,The bigger the bubble,the bigger the impact factor;The ordinate and color of the bubble represent the P values for enrichment analysis,The darker the color,the smaller the P value,The higher the enrichment degree is.

圖3 氨基酸生物合成途徑Fig.3 Biosynthesis of amino acids pathway

圖4 苯丙氨酸代謝途徑Fig.4 Phenylalanine metabolism pathway

植物體內(nèi)糖類(lèi)的形成、轉(zhuǎn)運(yùn)、貯藏和消耗與植物生理代謝對(duì)外界的響應(yīng)有緊密地聯(lián)系，逆境條件會(huì)影響植物體內(nèi)糖代謝途徑，因此，可以用糖代謝水平來(lái)衡量環(huán)境對(duì)植物的脅迫程度及植物對(duì)逆境環(huán)境適應(yīng)性的強(qiáng)弱[16]。黃相玲等[17]研究了小葉欖仁幼苗對(duì)鹽堿環(huán)境的適應(yīng)機(jī)理，結(jié)果表明，在0.6%～1.0%鹽脅迫下，可溶性糖含量隨鹽濃度的升高呈遞增趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)中，脅迫后西伯利亞白刺葉片中包括乳糖、阿洛糖、赤蘚糖、海藻糖、脫水半乳糖、景天庚酮糖等在內(nèi)的22種糖類(lèi)的含量較脅迫前均顯著上調(diào)，這些糖類(lèi)代謝物主要參與糖降解、糖異生及半乳糖代謝途徑，在參與西伯利亞白刺的鹽脅迫應(yīng)答過(guò)程中，除了可以作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)外，所參與的這些代謝過(guò)程中還會(huì)釋放大量ATP可為白刺抵抗鹽脅迫環(huán)境提供重要能量。

脂肪酸是植物體內(nèi)一類(lèi)重要的生物活性物質(zhì)，其不僅是細(xì)胞膜脂的重要組成成分，還是生物體貯藏能量的主要來(lái)源[18]。張婧[19]通過(guò)比較中性鹽脅迫下兩種大豆的生長(zhǎng)參數(shù)，表明大豆的耐鹽能力主要是依靠脂肪酸等小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累。在脅迫后西伯利亞白刺葉片中檢測(cè)到11種脂肪酸，其中棕櫚酸和亞麻酸的濃度上調(diào)最為顯著，參與的代謝途徑主要是脂肪酸合成過(guò)程，通過(guò)合成脂肪酸來(lái)維持膜結(jié)構(gòu)的完整性，從而提高西伯利亞白刺的耐鹽性。

TCA循環(huán)不僅可為植物生命活動(dòng)提供能量，而且還將糖類(lèi)、脂類(lèi)及蛋白質(zhì)代謝緊密聯(lián)系在一起，同時(shí)，TCA循環(huán)產(chǎn)生的許多中間產(chǎn)物也是植物體內(nèi)許多重要物質(zhì)的合成原料[20]。代謝通路分析可知，鹽脅迫條件下西伯利亞白刺葉片中檸檬酸、異檸檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸及蘋(píng)果酸等代謝物含量均顯著上調(diào)，表明鹽脅迫條件下白刺葉片中TCA循環(huán)顯著增強(qiáng)，這為其抵抗鹽脅迫提供了更多的能量，同時(shí)又將代謝組的多個(gè)耐鹽相關(guān)代謝物聯(lián)系起來(lái)，成為西伯利亞白刺耐鹽機(jī)制的重要組成部分。

鹽脅迫條件下西伯利亞白刺葉片中氨基酸代謝、糖代謝、脂肪酸代謝均參與滲透調(diào)節(jié)，TCA循環(huán)過(guò)程也顯著增強(qiáng)，說(shuō)明西伯利亞白刺不僅依靠糖代謝及TCA循環(huán)過(guò)程產(chǎn)生能量，還通過(guò)積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以適應(yīng)不良環(huán)境，西伯利亞白刺耐鹽機(jī)制較為完善。