文/吳依蒙 通訊作者/吳英良

前言

水飛薊作為治療肝病的植物藥已經(jīng)有兩千多年歷史[1]，水飛薊賓作為其主要活性成分之一，近年來廣泛應(yīng)用于治療肝炎、肝硬化及代謝中毒性肝損傷等疾病，大量的臨床研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊賓還具有抑制前列腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌等作用[2]，同時還具有抗氧化、清除自由基和抑制UV 誘導(dǎo)的皮膚炎癥等作用[3-4]。本文以小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞為研究對象，考察檢測水飛薊賓對細(xì)胞的形態(tài)、增殖、遷移、克隆、酪氨酸酶（Tyrosinase，TYR）活性以及黑色素合成量等方面的影響，為相關(guān)的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

儀器與材料

B16 細(xì)胞，中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院；RPMI-1640 培養(yǎng)液，康寧公司；胰蛋白酶/EDTA 消化液，批號：20180120-0222，天津?yàn)?；MTT，批號：804W056，北京索萊寶；Triton X-100，批 號：0694，Amresco；熊果苷（＞98%），批號：A0310A，美倫生物；L-dopa，批號：O0502A，美倫生物；水飛薊賓（HPLC 測定純度99%），江蘇鎮(zhèn)江句容市倍思特醫(yī)藥材料有限公司合成；ELx808 全自動酶標(biāo)儀，美國伯騰；1300 系列Ⅱ級A2 型生物安全柜，賽默飛世爾（蘇州）；AE2000 倒置生物顯微鏡，Motic；ULTS1368低溫冰箱，賽默飛世爾（蘇州）；TDZ5-WS 型離心機(jī)，湘儀集團(tuán)；HH-ZK2 恒溫水浴鍋，予華儀器。

方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)

B16細(xì)胞用RPMI-1640完全培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清）于37 ℃，5% CO2（培養(yǎng)箱內(nèi)空氣中CO2的體積分?jǐn)?shù)為5%）條件下培養(yǎng)。

2.MTT 比色法檢測細(xì)胞增殖率

取指數(shù)生長期的B16 細(xì)胞，經(jīng)消化分散制備為單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度，以每孔0.8×104個的細(xì)胞密度接種于96 孔板，培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞完全貼壁，棄去上清液，每孔加入100 μl 不同濃度的加藥培養(yǎng)基（水飛薊賓濃度分別為60μg/ml、30μg/ml、15μg/ml、7.5μg/ml），DMSO體積分?jǐn)?shù)小于0.5%。每個濃度設(shè)置3 個復(fù)孔，對照組加入新鮮培養(yǎng)液代替藥物溶液，培養(yǎng)72 h。棄去上清液，每孔加入含有5 g/L MTT 的培養(yǎng)液100 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去上清液，每孔加入100 μl DMSO，震蕩10 min。于酶標(biāo)儀測定各孔在490 nm下的吸光度（OD）值[5]。細(xì)胞增殖率按以下公式計算：細(xì)胞增殖率=（實(shí)驗(yàn)孔OD 值－空白孔OD 值）/（對照孔OD值－空白孔OD 值）×100%。

3.細(xì)胞形態(tài)觀察

將B16 細(xì)胞以每孔3×104個的細(xì)胞密度接種于6 孔板，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)貼壁后每孔分別加入不同濃度的加藥培養(yǎng)基（水飛薊賓濃度80μg/ml、40μg/ml、20μg/ml），對照組加入普通培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后置于顯微鏡下觀察對照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞大小、形態(tài)、生長密度及融合狀態(tài)等，拍照記錄。

4.對B16 細(xì)胞遷移活動的影響

取指數(shù)生長期的B16 細(xì)胞，以每孔3×104個的細(xì)胞密度接種于6 孔板，待細(xì)胞生長到融合度達(dá)90%～95% 時用槍頭在6 孔板底部劃線，DPBS 清洗3 次確保沒有松散細(xì)胞粘連。分別加入不同濃度的加藥培養(yǎng)基（水飛薊賓濃度80μg/ml、40μg/ml、20μg/ml）， 對照組加入新鮮培養(yǎng)液代替藥物溶液，20 h后顯微鏡下用相機(jī)拍照。

5.對B16 細(xì)胞克隆形成的影響

取指數(shù)生長期的B16 細(xì)胞，以每孔3×104個的細(xì)胞密度接種于6 孔板，培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞完全貼壁，棄去上清培養(yǎng)液，每孔分別加入不同濃度的加藥培養(yǎng)基（水飛薊賓濃度80μg/ml、40μg/ml、20μg/ml），每個濃度設(shè)置3 個復(fù)孔，對照組加入新鮮培養(yǎng)液代替藥物溶液。培養(yǎng)48 h，取藥物作用后的細(xì)胞調(diào)整成細(xì)胞懸液，以1×103個/皿培養(yǎng)21 天，用結(jié)晶紫染色，記錄拍照[6]。

6.對B16 細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性的影響

細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)處理同2，每孔分別加入100 μl 不同濃度的加藥培養(yǎng)基（水飛薊賓濃度分別為30 μg/ml、15 μg/ml、7.5 μg/ml），每個濃度設(shè)置3 個復(fù)孔，對照組加入濃度為80 μg/ml 的熊果苷，培養(yǎng)72 h。棄去上清液，DPBS 清洗兩次，每孔加入含1% TritonX-100 的DPBS緩沖液80 μl，迅速置于-80℃低溫冰箱2 h。取出置于常溫融化，37℃孵育5 min，加入20 μl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的L-dopa，37℃反應(yīng)2 h，于酶標(biāo)儀測定490 nm 的吸光度值。按如下公式計算酶活力：酪氨酸酶活性=實(shí)驗(yàn)組OD 值/對照組OD 值×100%

7.對黑色素合成量的影響

取指數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度以每孔3×104個接種于6 孔板，12 h 后棄去上清液，加入藥液（濃度同6），設(shè)置3 個復(fù)孔。培養(yǎng)72 h 后，用DPBS清洗2 次，消化并收集細(xì)胞于離心管中（共2 ml，其中取20 μl 稀釋一定倍數(shù)用于細(xì)胞計數(shù)），于1500 r/min 的條件下離心10 min，棄去上清液。加入2 ml的DPBS 用移液器輕輕吹打制成細(xì)胞懸液，加入500 μl 乙醇乙醚混合液（體積比1 ∶1），在室溫下放置30 min，于3000 r/min 的條件下離心5 min，棄去上清液，加入1 ml 含10%DMSO的1 mol/L NaOH 溶液，小心混勻，于80℃水浴孵育45 min，測定490 nm 吸光度值。黑色素合成總量=（實(shí)驗(yàn)組OD值/對應(yīng)細(xì)胞數(shù)）/（對照組OD 值/對應(yīng)細(xì)胞數(shù)）×100%

8.數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并且認(rèn)為P ＜0.05 時差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1.水飛薊賓對B16 細(xì)胞的增殖影響

利用MTT 法檢測不同濃度水飛薊賓（7.5 μg/ml、15 μg/ml、30 μg/ml、60 μg/ml）對B16 細(xì)胞增殖的影響（表1），與對照組相比，高濃度（60 μg/ml）水飛薊賓對B16 細(xì)胞具有顯著抑制作用，濃度為30 μg/ml、15 μg/ml 時，對細(xì)胞有一定的增殖促進(jìn)作用（但15 μg/ml濃度組與對照組相比無顯著差異），藥液濃度為7.5 μg/ml，細(xì)胞增殖率與對照組差異不大。

2.水飛薊賓對B16 細(xì)胞生長形態(tài)的影響

在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞在不同濃度藥物作用下的生長情況（圖1），對照組細(xì)胞生長良好，形態(tài)正常；水飛薊賓濃度為80 μg/ml 時，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，有較多漂浮死亡；濃度為40 μg/ml 時，細(xì)胞數(shù)量減少，形態(tài)成長梭形，與對照組相比變化明顯；濃度為20 μg/ml 時，細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)與對照組基本無區(qū)別。

圖1 水飛薊賓對B16 細(xì)胞生長形態(tài)的影響（x200）

圖2 水飛薊賓對B16 細(xì)胞遷移活動的影響（x40）

圖3 水飛薊賓對B16 細(xì)胞克隆形成的影響

表1 水飛薊賓對B16 細(xì)胞的增殖影響

表2 水飛薊賓對B16 細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性及黑色素合成量的影響

3.對B16 細(xì)胞遷移活動的影響

采用劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測水飛薊賓對B16 細(xì)胞的遷移及浸潤能力的影響（圖2），結(jié)果顯示水飛薊賓能抑制B16 細(xì)胞的遷移，且有劑量依賴性。

4.對B16 細(xì)胞克隆形成的影響

由圖3可看出，水飛薊賓作用于B16 細(xì)胞一定時間后，重新用普通培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)，依然有一定的抑制克隆的作用，且具有劑量依賴性。

5.水飛薊賓對B16 細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性及黑色素合成的影響

不同濃度水飛薊賓對B16 細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，水飛薊賓濃度為7.5 μg/ml 、15 μg/ml、30 μg/ml 時，對酪氨酸酶活性均有明顯的促進(jìn)作用（P ＜0.01），與對照組相比酪氨酸酶活性隨濃度升高而增強(qiáng)，但是對細(xì)胞內(nèi)黑色素合成的含量無明顯影響。

討論與結(jié)論

水飛薊賓被廣泛應(yīng)用于治療肝炎、肝硬化及代謝中毒性肝損傷等疾病[7]，根據(jù)其抗炎、抗自由基、降膽固醇等多種藥理作用，臨床還將其與瑞舒伐他汀等降血脂藥物聯(lián)用治療不穩(wěn)定心絞痛等疾病[8]。本研究證明了水飛薊賓除抑制前列腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌等作用外[9]，對小鼠黑色素瘤B16 細(xì)胞的生長、增殖、遷移、克隆等也有抑制作用，且發(fā)現(xiàn)水飛薊賓在濃度7.5～30 μg/ml 時能顯著增加B16 細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的活性，但對黑色素合成量無明顯影響。黑色素生物合成主要發(fā)生于黑色素細(xì)胞中的黑色素小體，以酪氨酸為底物，在酪氨酸酶的作用下合成黑色素。而細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶在黑色素合成過程中活性不是一成不變的[10]，酪氨酸酶從核內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程以及與黑素小體的膜融合受溶酶體相關(guān)細(xì)胞器生物合成復(fù) 合 物（BLOC-1，2，3） 等 影 響[11]。黑色素小體的形成、發(fā)展和代謝等也與多種因素有關(guān)[12-14]。本研究中水飛薊賓能促進(jìn)酪氨酸酶活性卻不影響黑色素合成量，可能是由于合成黑色素的其他條件所導(dǎo)致。酪氨酸酶來源于胚胎神經(jīng)鞘細(xì)胞，是黑色素代謝的關(guān)鍵酶[15]和白癜風(fēng)自身免疫的重要抗原。水飛薊賓作為一種安全、低毒、低副作用的天然藥物，迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)有急、慢性毒性，基因毒性等案例發(fā)生[16]。在歐美，一種含80%水飛薊素的乳薊提取物甚至已作為防癌的食品添加劑上市[17]。有報道還認(rèn)為根據(jù)其一定的抗菌、抗粘連作用，可以考慮將其作為膳食補(bǔ)充劑[18]。利用水飛薊賓同時具有的抗腫瘤及促進(jìn)酪氨酸酶活性的藥理作用，可進(jìn)一步研究發(fā)掘其在酪氨酸酶活性相關(guān)疾病，如白癜風(fēng)病或白化病中的作用，并為相關(guān)藥物臨床聯(lián)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。