王建忠，蘭俊，陸珍先，楊珺，呂華麗，潘志新，費(fèi)曉云

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基于SSR分子標(biāo)記的桉樹父本鑒定技術(shù)研究

王建忠1，蘭俊1＊，陸珍先1，楊珺2，呂華麗1，潘志新1，費(fèi)曉云1

(1.廣西國有東門林場，廣西 扶綏 532108；2.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083)

利用篩選出的11對SSR引物進(jìn)行SSR分子標(biāo)記分析，通過比對子代與母本相同引物對應(yīng)標(biāo)記位點(diǎn)的等位基因配置，鑒別自由授粉過程中可能由母本自交產(chǎn)生的個體，并借助Cervus軟件應(yīng)用最大似然值法和遺傳排除法，從154個基因型候選父本中鑒定出D2、D3、D4、D7、D11、D19和D20等7個半同胞子代的遺傳父本分別為同一試驗林內(nèi)定植的尾巨桉DH18-04、DH18-20、DH32-29和DH241-2。研究對于今后進(jìn)一步深入探究桉樹自交不親和與近交衰退機(jī)制，準(zhǔn)確進(jìn)行子代父本鑒定和雜交親本重建，以及品種選育等工作具有重要指導(dǎo)意義。

桉樹；父本鑒定；SSR

20世紀(jì)80年代，中澳技術(shù)合作東門桉樹示范林項目引進(jìn)了大量桉樹基因資源，建立了亞洲最大的桉樹基因庫，并對遺傳材料進(jìn)行了卓有成效的改良，特別是在桉樹人工雜交育種方面最為顯著。通過制訂雜交育種策略，培育出了一大批優(yōu)良桉樹雜交種，育種技術(shù)處于世界先進(jìn)水平[1]。雜交育種過程中，如果缺乏相應(yīng)繁育親本間的雜交系譜信息或者遺傳數(shù)據(jù)，就會增加近親交配的機(jī)率，導(dǎo)致后代遺傳相似度增大，致使遺傳基礎(chǔ)狹窄。因此，在進(jìn)行桉樹人工雜交育種之前，首先應(yīng)該明確親本遺傳信息，為親本選擇提供理論基礎(chǔ)。

通常情況下，親本分析主要采用觀察記錄和遺傳標(biāo)記分析兩種方法開展[2]。由于育種工作中，往往可以通過觀察記錄種子的來源從而直接獲得母本的信息，因此親本分析以父本鑒定為主。對于木本植物而言，通過對每個子代及其候選父本進(jìn)行遺傳標(biāo)記分析，采用遺傳排除法或最大似然值法，可鑒定出候選父本。前者是基于孟德爾遺傳定律，即子代的等位基因一定來自雜交親本，根據(jù)多位點(diǎn)遺傳數(shù)據(jù)直接排除與后代具有不同位點(diǎn)的親本，從而逐次在候選父本中鑒定得到遺傳父本[3]。后者則最早由MEAGHER[4-5]提出，通過估計親本的似然性模型來預(yù)測最可能親本來源，可用于分析已知母本，或親本均不明確的子代對應(yīng)的遺傳親本，是父本鑒定中最常用的方法。

SSR分子標(biāo)記為共顯性標(biāo)記且遵從孟德爾遺傳定律，利用Cervus軟件中已知性別群體鑒定模型[6-7]，并結(jié)合遺傳排除法比對子代基因型與母本的對應(yīng)標(biāo)記點(diǎn)的等位基因配置[8]，可以對自交或雜交子代進(jìn)行判定[9]，并在大量候選父本中鑒定出雜交子代的遺傳父本[10-11]。CHAIX等[12]曾利用SSR分子標(biāo)記對巨桉()種子園進(jìn)行親本分析。PATTERSON等[13]則進(jìn)一步通過鑒定1 954個藍(lán)桉()子代的遺傳父本，對種子園花粉授粉方式進(jìn)行研究。GRATTAPAGLIA[14]采用SSR分子標(biāo)記，對桉樹種子園中經(jīng)自由授粉產(chǎn)生的優(yōu)良子代進(jìn)行父本鑒定，通過計算親本特殊配合力來評估種子園中親本植株的優(yōu)越性，進(jìn)而通過剔除對子代優(yōu)良性狀貢獻(xiàn)率低的親本實(shí)現(xiàn)對種子園的改建，從而建立一種向前選擇的策略來提高選育優(yōu)良品種的效率[10]。

本研究通過篩選得到的高多態(tài)性SSR引物，結(jié)合SSR分子標(biāo)記分析和遺傳排除法，對前期誘導(dǎo)獲得的尾巨桉()半同胞材料的親本來源進(jìn)行鑒定，從中鑒別出自交和雜交個體，并進(jìn)一步對雜交個體的父本來源進(jìn)行鑒定，從而建立一套桉樹子代父本鑒定及雜交親本重建的技術(shù)方法，為進(jìn)一步開展桉樹遺傳改良工作奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

研究材料來源于2015年收集的尾巨桉優(yōu)樹經(jīng)自然授粉結(jié)實(shí)得到的種子，經(jīng)播種育苗得到的半同胞子代。隨機(jī)選擇其中20個基因型作為半同胞子代父本鑒定的實(shí)驗材料。

上述半同胞子代來源于共同的母本M(尾巨桉無性系DH18-19)，其定植于廣西國有東門林場基因庫試驗林。該試驗林建于1999年5月，共收集桉樹無性系(家系)200余個，包含東門雜交無性系/家系(DH系列編號)、尾葉桉()家系(U系列編號)、佛羅里達(dá)雜交桉家系(F系列編號)、巴西雜交桉家系(E系列編號)等，各無性系(家系)單行5株，株行距為2 m × 3 m(圖1)。因來源于自然授粉結(jié)實(shí)，所以這些子代基因型的父本未知，候選父本可能來源于母本M定植的試驗林內(nèi)部，也可能來源于試驗林周邊行道樹或農(nóng)戶種植的雜交桉無性系商品林。

圖1 廣西國有東門林場基因庫采樣示意圖

注：M為母本(尾巨桉無性系DH18-19)，空位為因無性系植株死亡導(dǎo)致的缺失

1.2 實(shí)驗材料采集、DNA提取與SSR分析

上述半同胞子代，以及包含有它們共同母本M在內(nèi)的基因庫試驗林內(nèi)的所有無性系(家系)均是用于父本鑒定研究材料的采集對象。該試驗林保護(hù)行所用品種尾巨桉DH32-29，試驗林周邊商品林造林品種尾巨桉DH33-9、DH32-26、DH32-28等，以及周邊道路行所用品種雷林1號(No.1)等候選父本均是材料樣本的采集對象。除子代和母本M以外，共采集到154個基因型的候選父本。采集時，選擇幼嫩新葉作為樣本材料，每個基因型的葉片樣本經(jīng)編號后置入液氮內(nèi)速凍后放入足量的干冰中保存、運(yùn)輸，并盡快轉(zhuǎn)入-80℃超低溫冰箱進(jìn)行長期保存。

葉片樣本在液氮內(nèi)低溫研磨，使用植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司，中國)進(jìn)行總DNA提取，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢驗提取質(zhì)量。共使用3種引物，具體包括5’端包含有M13序列(5’TGTAAAACGACGGCCAGT3’)的上游引物，普通下游引物，以及標(biāo)有FAM(6-carboxyf-luorescein)、HEX(hexachloro-6-carboxyfluorescein)、ROX(6-carboxy-x-rhodamine)和TAMRA(tetrachloro-6-carboxyrhodamine)熒光標(biāo)記的M13引物(Schuelke，2000)。PCR總反應(yīng)體系為20 μL(2 μL DNA模板，10 μL PCR Master Mixes(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司，中國)，7.2 μL ddH2O，0.08 μL正向引物，0.32 μL反向引物，0.4 μL熒光引物)，程序設(shè)計為：94℃持續(xù)4 min；94℃持續(xù)30 s，退火溫度設(shè)置為56℃持續(xù)30 s，72℃持續(xù)30 s，共計25次循環(huán)；94℃持續(xù)30 s，退火溫度設(shè)置為53℃持續(xù)30 s，72℃持續(xù)30 s，共計25次循環(huán)；72℃持續(xù)10 min；4℃避光保存。使用ABI-3730XL基因分析儀(Appli-ed Biosystems公司，美國)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測定，測定結(jié)果使用GeneMarker(version 2.2.0)軟件(Soft-Genetics，USA)進(jìn)行讀取和分析[15]。

1.3 多態(tài)性引物篩選

以已有文獻(xiàn)報道的240對桉樹SSR引物作為篩選對象[16]。針對上述引物，以采集到的所有桉樹基因型DNA為模板依次分別進(jìn)行TP-M13-SSR PCR，篩選在不同基因型之間有良好多態(tài)性的SSR引物，并通過POPGENE (version 1.32)軟件(University of Alberta，Canada)計算所有多態(tài)性引物的等位基因位點(diǎn)數(shù)(NA)、有效等位基因數(shù)(NE)、觀察雜合度(HO)、期望雜合度(HE)等遺傳參數(shù)[17]。

1.4 自交個體的排除

桉樹雌雄同花，可能存在自交?；诿系聽栠z傳定律理論，通過比對子代與母本的等位基因配置，若在子代的等位基因配置中存在至少一個在母本的相應(yīng)標(biāo)記位點(diǎn)上未被發(fā)現(xiàn)的等位基因，則表明這一子代特有等位基因可能來源于其他親本，即可初步判定這一子代基因型并非來源于自交。

1.5 桉樹半同胞子代父本鑒定

本研究采用SSR多態(tài)性引物對已知母本的尾巨桉半同胞家系子代進(jìn)行父本鑒定。使用Cervus(version 3.0.7)軟件(Field Genetics，UK)，利用已知性別的群體鑒定模型進(jìn)行分析[6-7]，對半同胞家系中雜交子代的父本進(jìn)行分析，通過似然比值(LOD)來篩選最似父本。其中，LOD值表示與隨機(jī)候選父本相比，疑似父本傳遞給子代基因的可能性的大小。LOD值越大，表明鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性越高。當(dāng)LOD值大于0時，表明所鑒定出的親本為遺傳親本的可能性大于假設(shè)親本。若鑒定過程中出現(xiàn)相同LOD值的候選父本時，則進(jìn)一步采用△-統(tǒng)計對候選父本LOD值之間的差距進(jìn)行分析，通過在85% ~ 95%的置信區(qū)間內(nèi)運(yùn)行10 000次模擬來確定△-臨界值[6]。同時，使用Cervus軟件計算親本排除率EP1和EP2，其中EP1表示在雙親未知情況下，在候選父本群體中隨機(jī)取樣，被排除為疑似父本的概率，EP2表示在母本已知情況下，在候選父本群體中隨機(jī)取樣，隨機(jī)父本被排除為疑似親本的概率[3,18-19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 尾巨桉半同胞子代中自交個體的排除

經(jīng)過對已有文獻(xiàn)報道的240對SSR引物的初步篩選[16]，其中具有良好多態(tài)性的96對SSR引物被用來鑒定尾巨桉半同胞子代是否源于自交。結(jié)果顯示(圖2)，在7個半同胞子代D2、D3、D4、D7、D11、D19和D20中存在至少一個在母本M中的相應(yīng)標(biāo)記位點(diǎn)上未發(fā)現(xiàn)的等位基因，表明這些子代特有等位基因來源于母本以外的其他親本，即這些子代基因型并非來源于母本M的自交。

圖2 尾巨桉半同胞子代與母本SSR等位基因配置示意圖(部分示意)

2.2 尾巨桉半同胞子代父本鑒定引物的篩選

以半同胞子代、試驗林及周邊采集到的共163個基因型DNA樣本為模板，篩選得到表1中的11對具有較高多態(tài)性的引物：EUCeSSR0037、EUCeSSR0166、EUCeSSR0176、EUCeSSR0224、EUCeSSR0465、EUCeSSR0539、EUCeSSR0592、EUCeSSR0606、EUCeSSR0703、EUCeSSR1001、EUCeSSR1063。上述引物被用于7個半同胞子代的父本鑒定，并通過POPGENE軟件對每個多態(tài)性位點(diǎn)的等位基因數(shù)(NA)、有效等位基因數(shù)(NE)、觀察雜合度(HO)、預(yù)期雜合度(HE)和多態(tài)性信息含量(PIC)進(jìn)行估算，結(jié)果顯示：在163個基因型中每個位點(diǎn)檢測到3至16個等位基因；觀察和預(yù)期雜合度(HO和HE)分別為0.119至0.748(平均值為0.527)和0.311至0.814(平均值為0.618)；多態(tài)性信息含量為0.281至0.784(平均值為0.572)。通過Cervus軟件計算雙親未知情況下在候選父本群體中隨機(jī)取樣的排除率EP1，和已知母本情況下在候選父本群體中隨機(jī)取樣的排除率EP2，結(jié)果顯示11對引物對父本的排除率EP2大于99.8%，表明可以有效排除候選父本中的非遺傳父本。

表1 廣西國有東門林場基因庫內(nèi)無性系群體SSR位點(diǎn)遺傳變異參數(shù)

注：HO為觀察雜合度，HE為預(yù)期雜合度；PIC為多態(tài)性信息含量，EP1為在候選父本群體中隨機(jī)取樣，被排除為疑似父本的概率；EP2為當(dāng)母本已知時，在候選父本群體中隨機(jī)取樣，被排除為疑似父本的概率。

2.3 尾巨桉半同胞子代父本鑒定

篩選得到的11對SSR引物被用于7個半同胞子代的父本鑒定，經(jīng)過Cervus軟件計算，結(jié)果顯示(表2)：在母本已知的情況下進(jìn)行父本鑒定，7個基因型均未出現(xiàn)與母本對應(yīng)SSR位點(diǎn)上相異的等位基因；7個半同胞子代的LOD值均為正值，介于1.34至5.09之間；7個基因型均未與最似父本出現(xiàn)位點(diǎn)錯配情況，因而鑒定得到唯一父本。

表2 Cervus軟件父本鑒定分析表　　

3 討論

由生殖生物學(xué)特性所決定，桉樹具有較高的可能性發(fā)生自交[20-22]。盡管不同種桉樹均有不同步的花期[22]、特異性的花絲或柱頭長度[23]、胚珠或合子早期敗育[24]等自交不親和機(jī)制來減少自交的發(fā)生，但桉樹在自然授粉時仍有較高比率的自交后代產(chǎn)生[25-26]。近年來，由于不需要繁瑣的去雄工作，桉樹SVP(Single Visit Pollination)[27]、OSP(One Stop Pollination)[28]等“一步授粉”技術(shù)被廣泛應(yīng)用于雜交育種工作，該類方法雖然在蒴蓋開裂前提前授粉，但仍有接近5%自交個體的產(chǎn)生[13,29]。由于它們當(dāng)中的一些個體在8個月后才表現(xiàn)出胸徑生長的劣勢[30]，因此在育種工作中，自交個體對后續(xù)的苗期評價和選擇工作產(chǎn)生著負(fù)面影響。SSR分子標(biāo)記為共顯性標(biāo)記且遵從孟德爾遺傳定律。基于子代的等位基因一定來自其雙親的定律，通過比對子代基因型與母本的對應(yīng)標(biāo)記位點(diǎn)的等位基因配置，可以對自交或異交子代進(jìn)行判定，準(zhǔn)確率可達(dá)97% ~ 99%[9-10]。本研究應(yīng)用此方法，在20個半同胞基因型中，排除了自交個體，鑒定得到7個半同胞雜交子代。

在桉樹中，已被確認(rèn)并定名的種、亞種或變種超過900個[31]，并且亞屬內(nèi)各種之間可以自由雜交[32]。在開展桉樹遺傳改良工作時，通過明確現(xiàn)有優(yōu)良個體的親本來源并實(shí)現(xiàn)雜交親本重建，可有效提升雜交育種工作效率。SSR分子標(biāo)記可以有效地分析子代個體某個位點(diǎn)的基因組成，進(jìn)而快速的檢測其親本來源，并在桉樹、楊樹()等上得到應(yīng)用[10-11,33]。本研究應(yīng)用此方法，并結(jié)合采用位點(diǎn)逐一排除的遺傳排除法[8]，鑒定出同一母本M的7個半同胞子代分別來源于4個遺傳父本。其中構(gòu)成半同胞子代D7、D11和D20的雄配子來源于定植于母本M附近的同一遺傳父本DH18-20，這是因為桉樹作為典型蟲媒傳粉植物且蜜源豐富，在實(shí)驗中觀察到該母本在散粉季節(jié)吸引了大量螞蟻吸食花蜜，并往返于同一或相鄰植株的不同花枝和蟻穴之間，這可能是在鑒定異交子代時發(fā)現(xiàn)了較多自交個體的原因；其余4個基因型的遺傳父本則與母本相距超過60 m，這是由于借助蜜蜂等飛行昆蟲，桉樹花粉傳播距離最遠(yuǎn)可達(dá)數(shù)十公里[34-36]。

本研究利用篩選出的11對SSR引物進(jìn)行SSR分子標(biāo)記分析，通過比對子代與母本相同引物對應(yīng)標(biāo)記位點(diǎn)的等位基因配置，可用來鑒別自由授粉過程中可能由母本自交產(chǎn)生的個體；借助Cervus軟件應(yīng)用最大似然值法可以對尾巨桉半同胞子代的遺傳父本進(jìn)行鑒定，此基礎(chǔ)上結(jié)合遺傳排除法，鑒定出7個半同胞子代的遺傳父本分別為同一試驗林內(nèi)定植的尾巨桉DH18-04、DH18-20、DH32-29和DH241-2。上述研究對于未來進(jìn)一步深入探究桉樹自交不親和和近交衰退機(jī)制，準(zhǔn)確進(jìn)行子代父本鑒定和雜交親本重建，以及開展品種選育等工作具有重要指導(dǎo)意義。

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Study on Using SSR Markers for Paternal Identification in

WANG Jianzhong1, LAN Jun1, LU Zhenxian1, YANG Jun2, LV Huali1, PAN Zhixin1, FEI Xiaoyun1

(1.,,,; 2.,)

A technique for male parent identification using SSR markers inhalf-sib progenies was developed in the study reported here. Eleven selected SSR loci with high polymorphism were used to identify the selfed individuals in an open pollinated population, based on the comparison of marker loci with the same primers between progenies and female parents. According to maximum likelihood scores obtained from analyses by Cervus software,clones DH18-04, DH18-20, DH32-29 and DH241-2 were identified as the male parents of the outcrossed progenies D2, D3, D4, D7, D11 and D20, respectively. This research has important significance for guiding further examination of self-incompatibility, paternal identification and hybrid parental reconstruction in these eucalypt taxa.

; paternal identification; SSR

Q943

A

廣西創(chuàng)新驅(qū)動發(fā)展基金項目(桂科AA17204087-3)

王建忠(1985― )，男，碩士，工程師，主要從事桉樹遺傳改良及無性系開發(fā)研究，E-mail: 379760245@qq.com

蘭俊(1981― )，男，碩士，高級工程師，主要從事桉樹遺傳改良及無性系開發(fā)研究，E-mail: lanjun107@aliyun.com