血液透析和腹膜透析對(duì)終末期腎臟病患者腸道菌群的影響

羅丹　張俊　趙文波　林洪春　楊婕綸　李詠倢　彭暉

【摘要】 目的探討血液透析和腹膜透析對(duì)終末期腎臟?。?ESRD）患者腸道菌群的影響。方法選擇健康對(duì)照者19名（健康對(duì)照組）、未透析的ESRD患者38例（未透析組）、持續(xù)腹膜透析的ESRD患者25例（PD組）、持續(xù)血液透析的ESRD患者27例（HD組），使用16S rDNA測(cè)序分析研究對(duì)象的糞便樣品中腸道微生物群的組成和功能。結(jié)果與健康對(duì)照組比較，未透析的ESRD患者α多樣性中的Simpson指數(shù)升高（P<0.05），未透析組、PD組、HD患者腸道菌群的α多樣性O(shè)bserved species指數(shù)、Chaol指數(shù)和Simpson指數(shù)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）。B多樣性分析顯示4組之間物種組成結(jié)構(gòu)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.05）。健康對(duì)照組及未透析組腸道菌群以擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)為主。與未透析組相比，HD組腸道菌群擬桿菌門(mén)減少（P<0.01）。4組研究對(duì)象的腸道菌群在科水平分類中比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的菌科有8個(gè)（P均<0.05），其中PD組和HD組腸道中普雷沃特爾菌科比例均較低。與未透析組比較.HD組腸道中毛螺菌科比例增加、脫硫弧菌科和紫單胞菌科比例降低;HD組腸道中理研菌科減少（P均< 0.05）。與健康對(duì)照組相比，未透析組腸道中紫單胞菌科比例增加（P<0.05）。丹毒絲菌科比例在未透析組、PD組、HD組腸道中均有所增加，產(chǎn)堿菌科和韋榮氏菌科比例在健康對(duì)照組、未透析組、PD組腸道中相近，但在HD組腸道中降低（P均<0.05）。結(jié)論血液透析和腹膜透析治療未明顯破壞腸道菌群的多樣性，但改變了ESRD患者腸道菌群的種類和數(shù)量。

【關(guān)鍵詞】 腸道菌群;終末期腎臟病;透析;16S r脫氧核糖核酸測(cè)序

人類的腸道中含有超過(guò)100萬(wàn)億個(gè)微生物，它們影響著宿主的營(yíng)養(yǎng)、代謝、生理和免疫功能[1]。腸道微生物包括細(xì)菌、真菌、古生菌、原生動(dòng)物和病毒等，主要以細(xì)菌為主[2]。多項(xiàng)研究表明，慢性腎臟病（ CKD）患者腸道菌群的種類和數(shù)量都較健康人群發(fā)生了變化，導(dǎo)致致病菌的增多或腸道代謝產(chǎn)物的蓄積，這些都會(huì)進(jìn)一步影響疾病的進(jìn)程和預(yù)后[3-4]。當(dāng)CKD發(fā)展到終末期腎臟病（ESRD）時(shí)，最常見(jiàn)的治療為血液透析和腹膜透析，因血液透析的患者會(huì)以動(dòng)靜脈瘺/移植物或靜脈導(dǎo)管的形式存在血管通路以及嚴(yán)格的飲食限制，而腹膜透析存在長(zhǎng)期的腹膜導(dǎo)管和不斷流人的含有微生物營(yíng)養(yǎng)素的腹膜透析液，這些都可能進(jìn)一步影響人類腸道菌群的組成及功能[5]。目前關(guān)于血液透析及腹膜透析對(duì)腸道菌群影響的研究較少，相關(guān)研究主要集中于將ESRD患者或替代治療的患者腸道菌群與健康對(duì)照者比較，沒(méi)有與未接受血液透析或腹膜透析治療的ESRD患者相比，因?yàn)槟c道菌群的改變可能是替代治療或CKD本身（或兩者兼有）的結(jié)果。針對(duì)這一問(wèn)題，進(jìn)一步確認(rèn)血液透析和腹膜透析對(duì)ESRD患者腸道菌群的影響十分必要。為此，本研究選擇了健康志愿者、未透析的ESRD患者和行腹膜透析或血液透析的ESRD患者，使用16S rDNA測(cè)序分析其糞便樣品中腸道微生物群的組成和功能，現(xiàn)報(bào)告如下。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

選擇2018年8月至2019年2月就診于我院的健康體檢者或ESRD患者。ESRD的診斷標(biāo)準(zhǔn)：利用CKD流行病學(xué)公式計(jì)算腎小球?yàn)V過(guò)率，腎小球?yàn)V過(guò)率<15 ml/（ min.1.73 m2）。排除標(biāo)準(zhǔn)：腹瀉者，不能自行進(jìn)食或使用腸內(nèi)、外營(yíng)養(yǎng)干預(yù)者，胃腸道腫瘤、膽道炎癥、炎癥性腸病等消化道疾病者，近3個(gè)月有局部炎癥、全身性感染者，近3個(gè)月服用抗生素、免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素、益生菌等藥物者。共納入109例研究對(duì)象，分為4組：腎功能正常的健康志愿者19名（健康對(duì)照組）、未透析的ESRD患者38例（未透析組）、持續(xù)規(guī)律腹膜透析6個(gè)月以上的ESRD患者25例（PD組）、持續(xù)規(guī)律血液透析6個(gè)月以上的ESRD患者27例（HD組）。本研究操作程序遵循中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)制訂的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，所有操作均征得研究對(duì)象或其親屬的知情同意。

二、研究方法

1.樣品采集

用無(wú)菌棉簽取中段成型大便放入無(wú)菌大便盒，做好標(biāo)記，迅速放入超低溫冰箱中儲(chǔ)存。

2.腸道菌群的檢測(cè)

采用16S rDNA測(cè)序分析，通過(guò)糞便DNA基因組提取試劑盒（美國(guó)Qiagen）提取糞便樣品中的DNA，特異性擴(kuò)增樣品中的微生物16S rDNA的高變區(qū)，采用高通量測(cè)序平臺(tái)Hiseq或Miseq對(duì)高變區(qū)序列進(jìn)行測(cè)序，然后通過(guò)生物信息學(xué)方法進(jìn)行序列分析和物種注釋，了解樣品的群落組成情況。

3.數(shù)據(jù)分析

使用Illumina Hiseq或Miseq測(cè)序平臺(tái)獲得的原始測(cè)序序列，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行剪切過(guò)濾，獲得有效數(shù)據(jù);通過(guò)測(cè)序序列之間的重疊關(guān)系將序列貼上標(biāo)簽，在給定的相似度下將標(biāo)簽聚類成可操作分類單元（ OTU），選取OTU的代表性序列，與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)獲得物種注釋，從而得到每個(gè)樣品的群落組成信息。腸道菌群的多樣性可用α多樣性和β多樣性進(jìn)行分析，α多樣性中的Observed species指數(shù)和Chaol指數(shù)反映樣品中群落的豐度，即僅考慮群落中物種的數(shù)量，而不考慮群落中每個(gè)物種的豐度情況。α多樣性中的Simpson指數(shù)同時(shí)考慮了物種組成的豐度和均勻度2個(gè)因素，Simpson指數(shù)越高表示腸道菌群分布越不均勻[6]。基于OTU代表序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)合物種豐度信息，通過(guò)主坐標(biāo)分析（ PCoA），進(jìn)一步比較不同樣品和分組的群落結(jié)構(gòu)差異。通過(guò)LDA分析（線性回歸分析）在各組之間進(jìn)行兩兩比較，當(dāng)中有顯著作用的微生物類群獲得LDA分值（篩選條件LDA分值>2.0，P<0.05），展現(xiàn)組中豐度有顯著差異的菌。B多樣性用Unifrac距離矩陣比較生物的多樣性。Unifrac距離矩陣分為Weighted（加權(quán)）和Unweighted（非加權(quán)）2種方法，對(duì)不同樣品間的微生物群落構(gòu)成進(jìn)行比較。其中加權(quán)計(jì)算方法僅考慮物種有無(wú)的變化，對(duì)稀有物種比較敏感，加權(quán)計(jì)算方法同時(shí)考慮物種有無(wú)和物種豐度的變化，對(duì)豐度較高的物種更加敏感。同時(shí)記錄距患者采集大便標(biāo)本當(dāng)日最近1次的實(shí)驗(yàn)室相關(guān)檢查數(shù)據(jù)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

通過(guò)LEfSe對(duì)分組樣品的物種組成和群落結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，區(qū)別2個(gè)或2個(gè)以上生物條件（或者是類群）。該算法強(qiáng)調(diào)的是統(tǒng)計(jì)意義和生物相關(guān)性。使用SPSS 23.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，正態(tài)分布的計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn);非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（上、下四分位數(shù)）表示，2組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，多組間比較Kruskal-Wallis檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用Z2檢驗(yàn)?？傮w比較P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，非正態(tài)分布的計(jì)量資料4組間兩兩比較用Bonferroni法校正檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05/6= 0.008為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、健康對(duì)照組、未透析組、PD組、HD組的臨床資料比較

健康對(duì)照組、未透析組、PD組、HD組的性別、年齡、BMI、血脂比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05），4組的血尿素氮、血肌酐、腎小球?yàn)V過(guò)率、血紅蛋白、血清白蛋白、血鉀、血鈣、血磷比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均< 0.05）。未透析組、PD組、HD組的糖尿病、高血壓病患者比例比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05），PD組與HD組的透析時(shí)間及透析充分性比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05），見(jiàn)表1。

二、腸道菌群多樣性的改變

健康對(duì)照組、未透析組、PD組、HD組的Observed species指數(shù)和Chaol指數(shù)組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）。與健康對(duì)照組比較，未透析組ESRD患者α多樣性中的Simpson指數(shù)升高（P<0.008），HD組與PD組間Simpson指數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.008），見(jiàn)表2。Unifrac距離矩陣圖非加權(quán)結(jié)果中未透析組、PD組、HD組部分患者與健康對(duì)照組空間距離較遠(yuǎn)，提示組間物種組成結(jié)構(gòu)有差異，但各組之間未見(jiàn)明顯分群。未透析組、PD組、HD組患者腸道菌群組內(nèi)樣本較分散，而健康者的樣本較集中（圖1A），提示患者腸道菌群個(gè)體差異較大?；诜羌訖?quán)的PCI主成分和PC2主成分對(duì)4組研究對(duì)象進(jìn)行分析，0表示兩個(gè)微生物群落間OTU的種類一致，采用Bonferroni法校正檢驗(yàn)水準(zhǔn)后，各組間PCI主成分和PC2主成分兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.008），見(jiàn)圖1B、C。加權(quán)結(jié)果中，4組研究對(duì)象的菌群均較為分散（圖1D），0則表示群落間OTU的種類和數(shù)量均一致，基于加權(quán)的PC1主成分分析顯示HD組的多樣性與ESRD組和PD患者均不同（P均< 0.008），在PC2主成分方面，4組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)圖1E、F。

三、各組之間腸道菌群組成的差異性分析

腸道菌群按照門(mén)、綱、目、科、屬進(jìn)行分類，與健康對(duì)照組比較，未透析組中居前3位的優(yōu)勢(shì)菌種為紫單胞菌科（Porphyromonadaceae）、副桿菌屬（Parabacteroides）、顫螺旋菌屬（Oscillo.spira）;PD組中居前3位的優(yōu)勢(shì)菌種為紫單胞菌科、副桿菌屬、布勞特菌屬（Blautia）;HD組中居前3位的優(yōu)勢(shì)菌種為瘤胃球菌屬（ Ruminococcus）、布勞特菌屬、糞球菌屬（ Coprococcu.s）。4組患者的腸道中均以擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）和厚壁菌門(mén)（Firmicutes）為主（圖2A）。在相對(duì)豐度排名前6位的菌門(mén)中，與未透析組相比，HD患者腸道中的擬桿菌門(mén)比例減少（圖2B），其余5個(gè)菌門(mén)如放線菌門(mén)（Actinobacteria）、厚壁菌門(mén)、梭桿菌門(mén)（Fusobacteria）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）、疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）組間分布均近似。在科水平上，有8個(gè)菌科在各組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），無(wú)論是與對(duì)照組還是未透析組比較，PD組和HD組患者腸道菌群中的普雷沃特爾科（Prevotellaceae）均減少（圖3A）。與未透析組比較，HD組毛螺菌科（Lachnospiraceae）比例較高、紫單胞菌科和脫硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）比例較低，PD組理研菌科（Rikenellaceae）比例較低（圖3B -D、H）。與健康對(duì)照組比較，未透析組紫單胞菌科比例較高，未透析組、PD組、HD組丹毒絲菌科（Erysipelotrichaceae）比例均較高（圖3B、E）。產(chǎn)堿菌科（Alcaligenaceae）和韋榮菌科（ Veillonellaceae）在健康對(duì)照組、未透析組、PD組中所占的比例相似（P均> 0.05），但在HD組中下降（圖3F、G）。

討 論

在我國(guó)，CKD的發(fā)生率逐年上升，多種因素如高血磷、高甲狀腺旁腺素和尿蛋白升高等均可以導(dǎo)致腎功能減退[7]。盡管可以利用血液透析或腹膜透析幫助緩解患者的癥狀，但ESRD患者仍會(huì)出現(xiàn)各種并發(fā)癥，病死率較高。WHO預(yù)測(cè)，至2030年，每10萬(wàn)人中有14人因CKD死亡，病死率將持續(xù)增加[8]。CKD患者除了需要長(zhǎng)期接受藥物治療，如抗生素、糖皮質(zhì)激素或免疫抑制藥、鈣磷調(diào)節(jié)藥物等，還需嚴(yán)格控制飲食，如避免食用富含鈉、鉀和磷酸鹽的食物等，這些均可影響腸道菌群的定植及生長(zhǎng)，易導(dǎo)致心血管疾病、感染、貧血、內(nèi)環(huán)境代謝紊亂等的發(fā)生、發(fā)展[9]。正常情況下，腸黏膜屏障可阻止有害微生物或毒性代謝產(chǎn)物進(jìn)入血液循環(huán)，腸道菌群能夠維持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。腸道菌群失調(diào)時(shí)，產(chǎn)生多種毒素，并通過(guò)受損的腸黏膜上皮進(jìn)入血循環(huán)。

本研究顯示，未透析組的腸道菌群α多樣性較健康對(duì)照組下降，但HD組和PD組的α多樣性與未透析組相似。β多樣性未見(jiàn)明顯分群，但主成分統(tǒng)計(jì)分析顯示各組間存在差異，未透析組、PD組、HD組的組內(nèi)差異較大，提示透析可影響ESRD腸道菌群多樣性，但未造成嚴(yán)重破壞。Crespo-Salgado等[10]對(duì)接受腹膜透析或血液透析治療的美國(guó)中西部?jī)和湍挲g匹配健康兒童的腸道微生物群進(jìn)行比較，采用腹膜透析Whole tree和Chaol指數(shù)評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示血液透析患兒腸道菌群與健康兒童相似，腹膜透析患兒的α多樣性顯著下降。另有研究對(duì)中國(guó)南方的ESRD患者和健康對(duì)照者進(jìn)行腸道菌群測(cè)序分析，結(jié)果顯示兩者的α多樣性和β多樣性相似[11]。由此推測(cè)，研究結(jié)果不一樣可能是受年齡、種族、地域、基礎(chǔ)病因等多種因素的影響。

本研究還顯示，未透析組腸道中普雷沃特爾科減少，但在PD組和HD組中減少更明顯。HD組腸道中毛螺菌科所占的比例比未透析組明顯增加。普雷沃特爾科和韋榮氏菌科均可產(chǎn)生短鏈脂肪酸[12]。擬桿菌門(mén)主要產(chǎn)生琥珀酸鹽和乙酸鹽[13]。短鏈脂肪酸包括丙酸鹽，乙酸鹽和丁酸鹽，具有維持腸道屏障功能和抗炎作用[14]。腹膜透析和血液透析造成產(chǎn)生短鏈脂肪酸的菌群減少，易導(dǎo)致腸道屏障的破壞和炎癥反應(yīng)的發(fā)生。有研究表明，CKD患者發(fā)生心腦血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)與毛螺菌科過(guò)度生長(zhǎng)及普雷沃特爾科的減少有關(guān)[3]。上述研究結(jié)果均提示，透析患者易發(fā)生心腦血管疾病的原因可能與某些腸道菌群的數(shù)量變化有關(guān)。普雷沃菌屬（Prevotella）的下降影響糞便的形成及排空[15]。腸道菌群紊亂易導(dǎo)致便秘，代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)經(jīng)腸道上皮吸收增加，促進(jìn)尿毒癥毒素的累積。丹毒絲菌科與結(jié)腸癌和胃腸道炎癥性疾病相關(guān)，還與代謝性疾病相關(guān)，在肥胖或高膽固醇血癥人群腸道中具有更高比例的丹毒絲菌科[16]。上述研究均提示，ESRD和透析治療會(huì)導(dǎo)致腸道中某些潛在致病菌的增多，疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加。

脫硫弧菌科是變形桿菌的一個(gè)亞目，是一種硫酸鹽還原微生物，可利用硫酸鹽進(jìn)行無(wú)氧呼吸，將其還原為硫化氫，一定量的硫化氫對(duì)腸黏膜具有保護(hù)性作用[17]。然而，高濃度的硫化氫對(duì)結(jié)腸收縮性有抑制作用[18-19]的比例多于健康對(duì)照組。與未透析組相比，HD組脫硫弧菌科減少，與健康對(duì)照組相近。此外，在4組研究對(duì)象中僅HD組腸道中產(chǎn)堿菌科減少，有報(bào)道指，腸道中脫硫弧菌科和產(chǎn)堿菌科可以產(chǎn)生脲酶[11]。脲酶分解尿素所產(chǎn)生的氨，會(huì)導(dǎo)致腸道上皮屏障結(jié)構(gòu)和功能的大量破壞，使得腸道源性尿毒癥毒素、內(nèi)毒素、抗原和腸道微生物或其他微生物產(chǎn)物進(jìn)入循環(huán)[15]。有報(bào)道紫單胞菌科的富集與腺瘤和癌有關(guān)[20]。本研究中，未透析組中腸道中紫單胞菌科增多，而HD組腸道中紫單胞菌科減少。由此推測(cè)，血液透析在一定程度上可以改善機(jī)體的內(nèi)環(huán)境紊亂，幫助恢復(fù)腸道菌群的平衡。

Stadlbauer等[21]研究了3例ESRD患者（15例血液透析，15例腹膜透析）的糞便微生物組成和功能，并與21名健康對(duì)照者進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，與健康對(duì)照者相比，血液透析患者的潛在致病菌增加、有益菌減少，腹膜透析患者的有益菌減少程度較小，并提出了腸道菌群的變化與患者炎癥相關(guān)，而與腸道通透性無(wú)關(guān)，腎臟替代治療是ESRD中生態(tài)失調(diào)的重要因素。多項(xiàng)研究已經(jīng)報(bào)道過(guò)ESRD患者存在腸道菌群失衡，本研究增加了研究對(duì)象的樣本量，并進(jìn)行腹膜透析和血液透析患者與未透析的ESRD患者腸道菌群構(gòu)成的比較，排除了ESRD本身對(duì)腸道菌群的影響，進(jìn)一步明確了透析對(duì)ESRD患者的影響，以及血液透析和腹膜透析對(duì)腸道菌群改變的不同之處，有助闡明透析造成ESRD患者微量元素及其他臨床相關(guān)指標(biāo)改變的原因，為改善ESRD患者的生活質(zhì)量提供策略。

本研究有一定的局限性。本研究是單中心橫斷面研究，樣本量較小，可能存在選擇偏倚。相對(duì)于其他物種來(lái)說(shuō)，人類個(gè)體間差異較大，易受飲食和藥物等多種因素的影響[22]。日后我們將繼續(xù)追蹤未透析的ESRD患者接受透析治療后腸道菌群的變化，避免個(gè)體差異帶來(lái)的影響。

綜上所述，無(wú)論是血液透析還是腹膜透析均改變了ESRD患者的腸道菌群組成，ESRD患者腸道菌群的多樣性受到了影響，但沒(méi)有遭到嚴(yán)重破壞。透析治療在某些程度上增加了一些潛在致病菌，易誘發(fā)感染、心血管疾病等并發(fā)癥，但也能通過(guò)透析幫助清除體內(nèi)毒素，抑制致病菌的生長(zhǎng)繁殖和促進(jìn)有益菌的積累，從而緩解腸道菌群的紊亂。腸道微生物群的改變與透析治療腎臟疾病是一個(gè)相互作用的過(guò)程，維持透析患者腸道微生態(tài)平衡具有重要作用。

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