紅樹(shù)林來(lái)源真菌Xylaria sp. HNWSW-2異香豆素類(lèi)次生代謝產(chǎn)物及其生物活性的研究

權(quán)云帆 王佩 王昊 袁靖喆 戴好富 梅文莉

摘 ?要 ?為了研究紅樹(shù)林來(lái)源真菌Xylaria sp. HNWSW-2的次生代謝產(chǎn)物及其生物活性，綜合利用多種色譜技術(shù)對(duì)該菌株發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，結(jié)合波譜學(xué)與理化常數(shù)分析進(jìn)行化合物結(jié)構(gòu)鑒定，分別采用液體浸泡法和Ellman比色法對(duì)化合物的全齒復(fù)活線蟲(chóng)致死活性和乙酰膽堿酯酶抑制活性進(jìn)行測(cè)試。從Xylaria sp. HNWSW-2發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯萃取物中分離鑒定了7個(gè)異香豆素類(lèi)化合物，分別為 （S）-（+）-8-O-methylmellein （1），（3S，4S）-（+）-4-hydroxy-8-O- met hylmellein （2），（3S，4R）-（+）-4-hydroxy-8-O-methylmellein （3），（3S，4S）-（+）-4-hydroxymellein （4），（3S，4R）-（+）-4- hydroxym ell ein （5），（3R，4R）-（-）-4-hydroxy-5-methylmellein （6）和（3R，4S）-（+）-4-hydroxy-5-methylmellein （7）。其中，化合物1具有較強(qiáng)全齒復(fù)活線蟲(chóng)致死活性，化合物1～3、6和7具有一定的乙酰膽堿酯酶抑制活性。本研究首次發(fā)現(xiàn)化合物（S）-（+）-8 O- methy mellein具有較強(qiáng)的抗線蟲(chóng)活性，為相關(guān)殺線蟲(chóng)藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 ?紅樹(shù)林;真菌;次生代謝產(chǎn)物;異香豆素;生物活性

中圖分類(lèi)號(hào) ?R284.1 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ?A

Abstract ?In order to study the secondary metabolites of the mangrove-derived fungus Xylaria sp. HNWSW-2 and the biological activities， seven isocoumarin derivatives were isolated by various column chromatographic techniques. The chemical structures were identified as （S）-（+）-8-O-methylmellein （1）， （3S，4S）-（+）-4-hydroxy-8-O-methylmellein （2）， （3S，4R）-（+）-4-hydroxy-8-O-methylmellein （3）， （3S，4S）-（+）-4-hydroxymellein （4）， （3S，4R）-（+）-4-hydroxymellein （5）， （3R，4R）-（-）-4-hydroxy-5-methylmellein （6） and （3R，4S）-（+）-4-hydroxy-5-methylmellein （7） based on a combined analysis of spectral data and physicochemical properties. In addition， all compounds were tested for the nematicidal activity against Panagrellus redivivus and acetylcholinesterase （AChE） inhibitory activity by liquid immersion method and Ellman colorimetric method， respectively. Among them， compound 1 exhibited nematicidal activity against P. redivivus. Compounds 1–3， 6 and 7 showed AChE inhibitory activity. The potential nematicidal activity of compound 1 would provide scientific evidences for its development of nematicide.

Keywords ?mangrove; fungus; secondary metabolites; isocoumarin derivatives; bioactive activities

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.08.023

紅樹(shù)林是分布于熱帶、亞熱帶海岸潮間帶的植物群落[1]。紅樹(shù)林獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境使得紅樹(shù)林來(lái)源微生物可能具有適應(yīng)該特殊環(huán)境的代謝機(jī)制，從而產(chǎn)生活性多樣的次級(jí)代謝產(chǎn)物[1]，例如具有抗腫瘤活性化合物2-（7-hydroxyoxooctyl） 3-hy dr oxy5-methoxybenzeneacetic acid ethyl ester，2-（3-吲哚基）-4H-1，3-苯并噁嗪-4-酮[2]和Norlichexanthone[3];具有乙酰膽堿酯酶抑制活性化合物anhydrojavanicin和beauvericin[4];具有α-葡萄糖苷酶抑制活性化合物botryorhodine F 和botryorhodine D[5];具有抗菌活性的peni ibr ocazine B[6]和5α， 8α環(huán)二氧麥角甾醇[7];具有抗炎活性的（-）-（R）-7-hydroxymellein[8]。近年來(lái)的海洋天然產(chǎn)物統(tǒng)計(jì)研究已經(jīng)將紅樹(shù)林來(lái)源真菌從海洋來(lái)源真菌中游離出來(lái)作為1個(gè)獨(dú)立的真菌來(lái)源進(jìn)行研究[9]。研究紅樹(shù)林來(lái)源真菌次生代謝產(chǎn)物對(duì)于尋找具有生物活性先導(dǎo)化合物有重要意義。

本研究組對(duì)紅樹(shù)植物木果楝莖組織來(lái)源真菌Xylaria sp. HNWSW-2次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，其發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯萃取物在25 mg/mL濃度下，表現(xiàn)出一定的全齒復(fù)活線蟲(chóng)致死活性，前期從中分離得到1個(gè)新的細(xì)胞松弛素，1個(gè)倍半萜及3個(gè)吡喃酮類(lèi)化合物[10]，其中吡喃酮類(lèi)化合物astropyrone表現(xiàn)出一定的乙酰膽堿酯酶抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性。本研究繼續(xù)從中尋找活性化合物，進(jìn)一步對(duì)該真菌的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，共分離鑒定了7個(gè)異香豆素類(lèi)化合物。

化合物4：白色粉末。+43.04 （c 0.47，MeOH），ESI-MS m/z 217處給出[M+Na]+峰，結(jié)合1H-NMR，13C-NMR和 DEPT 數(shù)據(jù)推測(cè)該化合物分子式為C10H10O4。1H-NMR （CDCl3， 500 MH z）：δ 10.93 （1H， s， 8-OH）， 7.50 （1H， dd， J = 8.5， 7.6 Hz， H-6）， 6.99 （1H， d， J = 8.5 Hz， H-7）， 6.90 （1H， d， J = 7.6 Hz， H-5）， 4.67 （1H， qd， J = 6.6， 2.1 Hz， H-3）， 4.54 （1H， d， J = 2.1 Hz， H-4）， 1.56 （3H， d， J = 6.6 Hz， H-9）。13C-NMR （CDCl3， 125 MHz）：δ169.4 （C-1）， 78.4 （C-3）， 67.2 （C-4）， 140.6 （C-4a）， 118.5 （C-5）， 136.9 （C-6）， 118.5 （C-7）， 162.0 （C-8）， 106.9 （C-8a）， 16.1 （C-9）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15-16]報(bào)道基本一致，根據(jù)波譜數(shù)據(jù)和理化性質(zhì)分析，結(jié)合文獻(xiàn)[15-16]比對(duì)，化合物4被鑒定為（3S，4S）-（+）-4- hydroxymellein。

化合物5：白色粉末。+8.95 （c 0.37，MeOH），ESI-MS m/z 427處給出[2M+K]+峰，結(jié)合1H-NMR，13C-NMR和DEPT數(shù)據(jù)推測(cè)該化合物分子式為C10H10O4。1H-NMR （CDCl3， 500 MHz）：δ 10.98 （1H， s， 8-OH）， 7.54（1H， dd， J = 8.5， 7.5 Hz， H-6）， 7.03 （1H， d， J = 7.5 Hz， H-5）， 6.99 （1H， d， J = 8.5 Hz， H-7）， 4.62 （1H， m， H-4）， 4.60 （1H， m， H-3）， 1.52 （3H， d， J = 6.2 Hz， H-9）。13C-NMR （CDCl3， 125 MHz）：δ 168.6 （C-1）， 80.1 （C-3）， 69.3 （C-4）， 141.3 （C-4a）， 116.4 （C-5）， 137.0 （C-6）， 118.0 （C-7）， 162.1 （C-8）， 106.8 （C-8a）， 18.1 （C-9）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16-17]報(bào)道基本一致，根據(jù)波譜數(shù)據(jù)和理化性質(zhì)分析，結(jié)合文獻(xiàn)[16-17]比對(duì)，化合物5被鑒定為（3S，4R）-（+）-4-hy droxymellein。

化合物6：白色粉末。14.99 （c 0.48，MeOH），ESI-MS m/z 247處給出[M+K]+峰，結(jié)合1H-NMR，13C-NMR和DEPT數(shù)據(jù)推測(cè)該化合物分子式為C11H12O4。1H-NMR （CDCl3， 500 MHz）：δ 10.98 （1H， s， 8-OH）， 7.38 （1H， d， J = 8.6 Hz， H-6）， 6.94 （1H， d， J = 8.6 Hz， H-7）， 4.64 （1H， br d， J = 2.1 Hz， H-4）， 4.61 （1H， m， H-3）， 2.36 （3H， s， H-10）， 1.63 （3H， d， J = 6.6 Hz， H-9）。13C-NMR （CDCl3， 125 MHz）：δ 169.9 （C-1）， 78.1 （C-3）， 64.6 （C-4）， 137.7 （C-4a）， 126.4 （C-5）， 139.1 （C-6）， 118.4 （C-7）， 160.6 （C-8）， 106.9 （C-8a）， 16.5 （C-9）， 17.3 （C-10）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道基本一致，根據(jù)波譜數(shù)據(jù)和理化性質(zhì)分析，結(jié)合文獻(xiàn)[18]比對(duì)，化合物6被鑒定為（3R，4R）-（-）- 4-hydroxy-5-methylmellein。

化合物7：白色粉末。+17.42（c 0.33，MeOH），ESI-MS m/z 231處給出[M+Na]+峰，結(jié)合1H-NMR，13C-NMR和DEPT數(shù)據(jù)推測(cè)該化合物分子式為C11H12O4。1H-NMR （CDCl3， 500 MHz）：δ 11.11 （1H， s， 8-OH）， 7.39 （1H， d， J = 8.6 Hz， H-6）， 6.97 （1H， d， J = 8.6 Hz， H-7）， 4.99 （1H， qd， J = 7.0， 1.5 Hz， H-3）， 4.73 （1H， d， J = 1.5 Hz， H-4）， 2.36 （3H， s， H-10）， 1.32 （3H， d， J = 7.0 Hz， H-9）。13C-NMR （CDCl3， 125 MHz）：δ 168.2 （C-1）， 80.2 （C-3）， 65.9 （C-4）， 135.3 （C-4a）， 127.2 （C-5）， 139.2 （C-6）， 118.4 （C-7）， 160.5 （C-8）， 106.9 （C-8a）， 18.3 （C-9）， 17.3 （C-10）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道基本一致，根據(jù)波譜數(shù)據(jù)和理化性質(zhì)分析，結(jié)合文獻(xiàn)[18]比對(duì)，化合物7被鑒定為（3R，4S）-（+）-4- hyd roxy-5-met h ylmellein。

化合物1～7結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖2。

2.3 ?生物活性測(cè)試結(jié)果

2.3.1 ?全齒復(fù)活線蟲(chóng)致死活性 ?對(duì)化合物1～7進(jìn)行全齒復(fù)活線蟲(chóng)致死活性測(cè)試，在濃度為2.50?mg/mL時(shí)化合物1表現(xiàn)出較強(qiáng)的全齒復(fù)活線蟲(chóng)致死活性，其致死率為（99.21±0.79）%，化合物2、4未表現(xiàn)出活性，化合物3、5～7表現(xiàn)出微弱的活性，其致死率均小于10%，結(jié)果見(jiàn)表1。

以阿維菌素為陽(yáng)性對(duì)照（PC），二甲基亞砜（DMSO，NC）為溶劑，進(jìn)行全齒復(fù)活線蟲(chóng)致死活性評(píng)價(jià)（圖3），化合物1在一定濃度范圍內(nèi)（2.50～0.08 mg/mL），均顯示顯著的線蟲(chóng)致死活

2.3.2 ?乙酰膽堿酯酶抑制活性 ?對(duì)化合物1～7進(jìn)行乙酰膽堿酯酶抑制活性測(cè)試，在終濃度為0.05?mg/mL時(shí)，化合物1～3、6和7表現(xiàn)出一定的乙酰膽堿酯酶抑制活性，抑制率分別為（23.13± 0.78）%，（26.59±0.66）%，（24.14±1.78）%，（10.45± 0.97）%和（15.08±0.94）%，化合物4和5活性微弱，其抑制率均小于10%，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 ?討論

本研究獲得7個(gè)化合物具有相同的苯并喃酮母核，主要區(qū)別在于4位、5位和8位取代基不同以及3位和4位構(gòu)型不同。化合物1與2～7的區(qū)別在于其4位無(wú)取代，而化合物2～7的4位均被羥基取代，推測(cè)該類(lèi)化合物4位被羥基取代會(huì)使該類(lèi)化合物活性降低。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，異香豆素類(lèi)化合物具有抗菌、細(xì)胞毒及抗炎等生物活性[3， 7， 19-20]，而對(duì)其線蟲(chóng)致死活性的相關(guān)報(bào)道較少，本研究報(bào)道了異香豆素類(lèi)化合物的全齒復(fù)活線蟲(chóng)致死活性，為相關(guān)殺線蟲(chóng)藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)，同時(shí)首次報(bào)道了該類(lèi)化合物乙酰膽堿酯酶抑制活性，豐富了異香豆素類(lèi)化合物的生物活性研究成果。

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