復(fù)方透骨香乳膏中黃柏的質(zhì)量控制研究

郭璐玫 姜 蓮 申 璀

貴州省食品藥品檢驗所，貴州 貴陽 550004

復(fù)方透骨香乳膏由透骨香、黃柏、川芎、當(dāng)歸等11味藥材組成，具有活血祛瘀、消腫止痛之功效，用于跌打損傷所致的局部軟組織損傷、疼痛。方中黃柏為主要藥味，具有明顯的消腫作用。實驗以黃柏對照藥材和鹽酸小檗堿對照品為指標(biāo)，對復(fù)方透骨香乳膏中的黃柏進(jìn)行薄層鑒別研究；含量測定則采用高效液相色譜法以鹽酸小檗堿為指標(biāo)性成分對黃柏質(zhì)量進(jìn)行控制。

1 儀器與材料

1.1 儀器 ThermoFisher Ultimate 3000(DAD)液相色譜儀；CAMAG薄層點樣儀；AE 200型(十萬分之一)電子天平(瑞士梅特勒托利多)、XP26型(百萬分之一)電子天平(瑞士梅特勒托利多)；millipore超純水機(jī)制備超純水。

1.2 材料 復(fù)方透骨香乳膏(貴州健瑞安藥業(yè)有限公司)，鹽酸小檗堿對照品(批號：110713-201212，含量以86.7%計)、黃柏對照藥材(批號：121510-200501)均來自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃柏TLC鑒別 取本品內(nèi)容物10 g，加甲醇40 mL，回流30 min，放冷，離心，取上清液，蒸干，加水20 mL溶解，加氨試液調(diào)pH值至11，加20 mL飽和氯化鈉溶液，以二氯甲烷萃取2次，合并二氯甲烷液，蒸干，加鹽酸甲醇溶液(1∶100)2 mL溶解，作為供試品溶液。另取黃柏對照藥材0.1 g，同法制成對照藥材溶液。再取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每l mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。按處方比例稱取除黃柏外其他藥材適量，制成缺黃柏的陰性對照樣品，同法制備缺黃柏的陰性對照溶液。照薄層色譜法(2015年版中國藥典四部通則0502)試驗，吸取供試品溶液5 μL，對照藥材溶液2 μL，對照品溶液1 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，正丁醇-冰乙酸-水(7∶1∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材、對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，且缺黃柏的陰性對照無干擾。如圖1所示。

2.2 鹽酸小檗堿HPLC含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Waters Xbridge C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(30∶70)；檢測波長：346 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min； 進(jìn)樣量：10 μL。理論塔板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計，應(yīng)不低于4000。

2.2.2 對照品溶液的制備 取鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，加鹽酸-甲醇(1∶100)的混合溶液制成每1 mL含13 μg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物適量，混勻，取約5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入鹽酸-甲醇(1∶100)的混合溶液50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理40 min，放冷，再稱定重量，用鹽酸-甲醇(1∶100)的混合溶液補(bǔ)足減失的重量，置冰箱冷凍(-10 ℃)30 min，取出，搖散，立即過濾，精密吸取續(xù)濾液20 mL，蒸干，殘渣用鹽酸-甲醇(1∶100)的混合溶液4 mL洗至5 mL量瓶中，超聲10 min，放冷，加鹽酸-甲醇(1∶100)至刻度，置冰箱中冷凍10 min，取出，搖散，立即濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性供試品溶液的制備 取缺黃柏陰性樣品，按2.2.3制備陰性供試品溶液，即得。

2.2.5 專屬性考察 取鹽酸小檗堿對照品溶液、復(fù)方透骨香乳膏供試品溶液及陰性供試品溶液各10 μL，按“2.2.1”色譜條件注入液相色譜儀，供試品溶液色譜在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置有相應(yīng)的色譜峰，且陰性無干擾。如圖2所示。

2.2.6 線性關(guān)系考察 精密取鹽酸小檗堿對照品(13.439 μg/mL)2 μL、5 μL、10 μL，鹽酸小檗堿對照品(26.877 μg/mL)10 μL、15 μL、20 μL依次注入液相色譜儀，測定峰面積。以對照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸計算，繪制工作曲線，得出線性回歸方程為：y=42685.6257x-26.2489，r=0.9999，鹽酸小檗堿在0.02688～0.5375 μg的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.7 精密度試驗 精密吸取同一鹽酸小檗堿對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖峰面積，鹽酸小檗堿對照品的峰面積RSD為0.08%，結(jié)果說明儀器精密度良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗 取同一批復(fù)方透骨香乳膏，按“2.2.3”供試品溶液制備方法制備6份，按“2.2.1”色譜條件測定鹽酸小檗堿的含量，結(jié)果測得平均含量為0.0257 mg/g，RSD%為0.9%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗 取復(fù)方透骨香乳膏供試品溶液，按“2.2.1”色譜條件，于0 h、2 h、8 h、12 h、18 h、24 h，測定峰面積，RSD%為1.2%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.10 回收率試驗 取已測定含量的復(fù)方透骨香乳膏(平均含量0.0257 mg/g)2.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入鹽酸小檗堿對照品溶液(0.001292 mg/mL)50 mL，按供試品溶液制備方法制備樣品溶液，并按“2.2.1”色譜條件測定鹽酸小檗堿的含量，計算回收率。結(jié)果見表1。

2.2.11 樣品含量測定 取3批樣品，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果見表2。

表1 回收率試驗數(shù)據(jù)(n=6)

表2 樣品測定結(jié)果 (n=2)

3 討論

復(fù)方透骨香乳膏現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)對黃柏的質(zhì)量控制只有鹽酸小檗堿薄層鑒別，缺乏專屬性，且供試品的制備方法可操作性和重現(xiàn)性較差，故本研究增加了黃柏對照藥材對薄層鑒別進(jìn)行質(zhì)量控制，并對供試品的制備方法進(jìn)行了研究，制得的供試品溶液提取率較高，有較好的分離效果。

鹽酸小檗堿的含量測定研究中，取鹽酸小檗堿對照品溶液在200～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描波長，在270 nm和346 nm出有較大吸收，經(jīng)過試驗摸索，以346 nm作為檢測波長時可獲得較高的靈敏度和良好的選擇，故確定鹽酸小檗堿的檢測波長為346 nm。研究比較了不同流動相的洗脫效果，用乙腈-0.4%磷酸溶液(32∶68)[1]作為流動相時，鹽酸小檗堿峰型不好，拖尾嚴(yán)重，流動相中加入少許離子對試劑十二烷基磺酸鈉或緩沖鹽試劑磷酸二氫鉀[2]，可改善峰型并達(dá)到較好的分離效果，經(jīng)試驗摸索，以乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(30∶70)為流動相時可得到較好峰型與分離度，故確定乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(30∶70)為流動相。此外，復(fù)方透骨香乳膏供試品溶液中的乳狀基質(zhì)不易除盡，若供試品溶液中含有乳狀基質(zhì)會對高效液相色譜儀造成損壞，故本研究在最大效率提取鹽酸小檗堿的同時，還考察了低極性有機(jī)溶劑脫脂[3]、離心[4]、冰浴[5]、冷凍等方法去除乳狀基質(zhì)，研究表明以冷凍法操作簡便，效果較佳，可得到澄明的供試品溶液。

本實驗對黃柏的TLC鑒別及鹽酸小檗堿的含量測定的研究，方法可靠穩(wěn)定，簡便易行，可更加全面、可靠地控制復(fù)方透骨香乳膏中黃柏的質(zhì)量，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升制定提供可靠的依據(jù)。