孫霽寒,王兆丹,孫桂菊,*,彭 景

(1.揚州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇揚州 225001;2.東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生系,江蘇南京 210009)

高脂血癥(hyperlipidemia,HLP)是指脂代謝異常導(dǎo)致血漿總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇及甘油三酯中一種或多種超過正常范圍的病癥。脂肪性肝病(fatty liver disease,FLD),是指肝細胞中脂肪堆積導(dǎo)致脂肪變性,引起肝臟代謝的異常,通常分為酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver disease,AFLD)和非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)。HLP可誘導(dǎo)肝脂肪變性,其中重度變性產(chǎn)生的高脂性脂肪肝(hyperlipidemic fatty liver,HFL)屬于NAFLD[1]。目前主要認為NAFLD發(fā)病機制與氧化應(yīng)激損傷、胰島素抵抗有關(guān),氧化應(yīng)激損傷可認為是NAFLD的重要環(huán)節(jié)[2]。

目前常見的治療HFL、FLD的藥物有他汀類、貝丁酸類、煙酸類、樹脂類和抗氧化劑,而他汀類作為臨床降血脂藥物,常用來聯(lián)合治療脂肪肝合并高脂血癥[3],多項研究已表明,辛伐他汀能顯著降低膽固醇,具有良好降血脂作用、服用簡便、不良反應(yīng)低等優(yōu)點[4-5]。

木犀草素(luteolin)作為食源性黃酮類化合物,廣泛存在于各種食用植物和傳統(tǒng)藥用植物中[6]。研究表明,木犀草素具有廣泛的生物活性,在心血管疾病[7]、肥胖[8]、治療癌癥[9-11]等方面正獲得越來越多的關(guān)注。周麗嫦等[12]研究表明,木犀草素可顯著抑制體重、血脂、血糖及胰島素水平的升高;馬寶慧等[13]研究表明,木犀草素的降脂作用可能與HDL的升高、LDL的降低和減少機體NO的產(chǎn)生有關(guān),提示木犀草素具有一定的降血脂作用。前期實驗表明,木犀草素中劑量(50 mg/kg)對SD高脂血癥大鼠有顯著降血脂和急性酒精性肝損傷保護作用[14-15]。

目前,關(guān)于木犀草素的研究主要停留在降血脂作用及其可能的機制,對肝脂肪變性以及抗氧化水平影響的研究較少,為此本研究通過病理切片以及對大鼠血脂和抗氧化指標的檢測,探討木犀草素對高脂血癥SD大鼠肝臟脂肪變性及抗氧化水平的影響,并旨在為今后研究開發(fā)木犀草素藥理保健功能提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

40只清潔級雄性SD大鼠 體質(zhì)量(200±9) g,購自南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心;羧甲基纖維素鈉(CMC)、木犀草素純品 南京澤朗醫(yī)藥公司;辛伐他汀 天津懷仁制藥有限公司;馬斯亮藍蛋白測定試劑盒、膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;低脂飼料D12450B、高脂飼料D12492 協(xié)同生物有限公司。

RT-6000酶標分析儀 美國雷杜公司;Centrifuge 5424R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司;Spectrumlab755s紫外可見分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司;DK-S26水浴鍋 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;BS224S電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;Milli-Q Advantage超純水系統(tǒng) 南京漢隆實驗器材有限公司;TYXH-II渦旋混合器 天悅電子。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型的建立與分組 40只雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機分為正常組10只和模型組30只。正常組喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料D12450B,模型組喂養(yǎng)高脂飼料D12492。4周后禁食8 h,稱重并斷尾取血,測定血清TC、TG、HDL-C、LDL-C,若TG、TC與正常組有顯著差異(p<0.05),則造模成功。將模型組再隨機均分為模型對照組、木犀草素組、辛伐他汀組。稱取5 g CMC加入1 L蒸餾水配成0.5%的CMC溶液,稱取木犀草素和辛伐他汀溶解于0.5%CMC溶液中配成灌胃溶液使其濃度都為10 mg/mL,干預(yù)期間正常組和模型對照組每天灌胃0.5%的CMC溶液(10 mL/kg),木犀草素組每天灌胃5 mL/kg 木犀草素溶液,辛伐他汀組每天灌胃1 mL/kg辛伐他汀溶液,各組動物自由攝食飲水,干預(yù)6周后處死。

1.2.2 體質(zhì)量、肝濕重等一般性指標的測定 干預(yù)期于每周一晨間稱重,干預(yù)結(jié)束后稱體質(zhì)量并處死后取出肝臟稱重,計算肝系數(shù)。

肝系數(shù)(%)=肝濕重/體質(zhì)量×100

1.2.3 血脂四項(TC、TG、HDL-C、LDL-C含量)的測定 干預(yù)結(jié)束后處死,股動脈取血,3000 r/min離心10 min取上層血清,按試劑盒說明采用COD-PAP酶法和GPO-PAP酶法,取2.5 μL血清樣本,同時取等量蒸餾水和校準品作為空白對照和標準對照,均加入250 μL工作液后37 ℃孵育10 min,波長510 nm處酶標儀測定血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C含量。

1.2.4 肝臟抗氧化指標的測定 制備成10%的肝組織勻漿,按試劑盒說明采用考馬斯亮藍法測肝勻漿蛋白濃度;采用TBA法測丙二醛(MDA)含量;采用比色法測谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)含量;采用可見光法測過氧化氫酶(CAT)含量;將肝組織勻漿稀釋至1%,按試劑盒說明采用羥胺法測超氧化物歧化酶(SOD)含量。

1.2.5 病理學(xué)檢查 取約3～5 mm2大小的肝組織,用10%福爾馬林溶液固定48 h,將組織切成0.2～0.5 cm的薄片,經(jīng)梯度酒精脫水二甲苯透明后,浸蠟包埋,將蠟塊切成約5 μm的切片,之后脫蠟洗凈,HE染色后脫水透明并進行封固,光學(xué)顯微鏡下100倍放大率觀察肝臟組織脂肪變性情況,采用Image-Pro Plus 6.0軟件觀察肝臟脂肪變性程度,根據(jù)病變范圍可分為6級[16]:0分(基本正常),1分(病變<5%),2分(病變5%～29%),3分(病變30%～49%),4分(病變50%～75%),5分(病變>75%)。

1.3 統(tǒng)計分析

采用Excel和SPSS 16.0處理分析數(shù)據(jù),結(jié)果以均數(shù)(標準差來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 模型建立

4周后鼠尾采血測血脂四項,由表1可知,與正常組相比,模型組血脂四項均顯著高于正常組(p<0.05),可認為高脂血癥SD大鼠造模成功,可進行進一步的干預(yù)實驗。

表1 造模4周后模型組和正常組血脂四項的比較

2.2 木犀草素對高血脂癥SD大鼠體重、肝質(zhì)量及肝系數(shù)的影響

臟器指數(shù)變化可以較好地判斷化學(xué)毒物對內(nèi)臟器官的損傷情況,臟器指數(shù)增加表示臟器有充血、水腫、增生及肥大等變化,下降表示臟器萎縮、生長受阻或退行性變化[17],因此采用體重、肝濕重和肝系數(shù)等一般性指標表觀評價大鼠肝臟的變化。由圖1各組大鼠的體重變化曲線可見,各組大鼠的體重均呈一定的上升趨勢,第4周開始,模型對照組的體重增長速度明顯快于其他組,表示隨著干預(yù)時間的延長,后期與模型對照組的增重速度相比,木犀草素能降低高脂血癥大鼠的增重速度,與辛伐他汀陽性藥物組相一致。

圖1 干預(yù)期各組大鼠體重變化曲線

由表2可知,模型對照組的體重、肝濕重及肝系數(shù)極顯著高于正常組(p<0.01);木犀草素組的體重、肝系數(shù)極顯著低于模型對照組(p<0.01),肝濕重?zé)o顯著性差異;辛伐他汀組的體重、肝濕重和肝系數(shù)極顯著低于模型對照組(p<0.01);與陽性藥物對照辛伐他汀組相比,木犀草素組沒有顯著性差異。體重、肝濕重和肝系數(shù)的變化均能一定程度地體現(xiàn)病理性變化,結(jié)果表明模型對照組大鼠的體重、肝重和肝系數(shù)極顯著的升高可能與一系列的病理變化有關(guān),經(jīng)過木犀草素和辛伐他汀的干預(yù)可能對肝臟的病理性變化有所改善,且兩者之前無顯著差異。

表2 各組大鼠體重、肝濕重及肝系數(shù)

2.3 木犀草素對高血脂癥SD大鼠血脂四項的影響

由表3可知,經(jīng)6周的干預(yù),模型對照組相比正常組,血清TC、TG、LDL-C、HDL-C含量顯著升高(p<0.05);與模型對照組相比,木犀草素干預(yù)組和辛伐他汀干預(yù)組的血清TC、TG、LDL-C含量顯著降低(p<0.05),HDL-C的含量變化無顯著性差異;木犀草素組和辛伐他汀組的各血脂指標間均無顯著性差異,表明木犀草素和辛伐他汀能極顯著降脂,且兩者無顯著性差異。

表3 木犀草素對高血脂癥SD大鼠血脂四項含量的影響

2.4 木犀草素對高血脂癥SD大鼠肝臟脂肪變性的影響

干預(yù)6周后采用HE染色,制備高血脂癥SD大鼠肝臟的病理切片,觀察脂肪的變性情況(圖2)。結(jié)果顯示,正常組細胞結(jié)構(gòu)規(guī)則整齊,肝竇清晰可見,肝細胞內(nèi)未出現(xiàn)脂滴。模型對照組肝竇消失,通過Image-Pro Plus6.0讀片發(fā)現(xiàn),超過30%的肝細胞脂肪變性,與正常組相比有極顯著差異(p<0.01)。木犀草素組脂滴明顯減少,脂變程度減輕,肝竇清晰。辛伐他汀組大鼠肝竇清晰,肝細胞內(nèi)脂滴明顯減少。肝臟脂肪變性評分統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果見圖3,與正常組相比,木犀草素組和辛伐他汀組有顯著差異(分別為p<0.01,p<0.05);與模型對照組相比,兩組評分均降低但無顯著性差異。從病理圖像結(jié)果表明木犀草素和辛伐他汀均能減輕大鼠的肝臟脂肪變性,從脂肪變性評分上表明木犀草素和辛伐他汀能降低脂肪變性程度,但無顯著性差異。

圖2 木犀草素對高血脂癥SD大鼠肝臟脂肪變性的影響(200×)

圖3 SD大鼠肝臟脂肪變性評分

2.5 木犀草素對高脂血癥SD大鼠肝臟抗氧化水平的影響

丙二醛(MDA)作為脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物之一,可間接反映過氧化損傷程度。SOD、GSH-Px、CAT等作為體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng),均可清除活性氧,反映機體的抗氧化能力[18]。表4結(jié)果顯示,與正常組相比,模型對照組MDA含量極顯著升高(p<0.01),CAT含量顯著降低(p<0.05),GSH-Px和SOD含量無顯著變化;與模型對照組相比,木犀草素組和辛伐他汀組的MDA含量極顯著降低(p<0.01),CAT含量顯著升高(p<0.05,p<0.01),GSH-Px和SOD含量無明顯變化,且無顯著組間差異。采用單因素方差分析LSD兩兩比較,結(jié)果表明與正常對照組相比,模型對照組出現(xiàn)了一定程度的氧化損傷,木犀草素和辛伐他汀干預(yù)組均能顯著改善氧化損傷程度,兩兩比較兩組之間無顯著性差異,但均值上看辛伐他汀抗氧化水平更好。

表4 木犀草素對高脂血癥SD大鼠肝臟抗氧化水平的影響

3 討論

脂肪肝與多種生理病理的改變有關(guān)。高脂血癥被認為是脂肪肝的首次打擊,破壞了脂質(zhì)代謝的平衡,導(dǎo)致TG合成增加,并以脂滴的形式沉積于肝臟[19]。Day[20]提出的“二次打擊學(xué)說”被認為較為全面地解釋了肝臟脂肪病變,該學(xué)說認為以氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化為核心的二次打擊導(dǎo)致了脂肪肝的發(fā)展,研究表明高脂血癥造成脂代謝紊亂,同時容易引起機體抗氧化水平失調(diào),即氧自由基產(chǎn)物增加和相關(guān)自由基清除酶活力降低[21]。因此降血脂、增加抗氧化能力成了治療脂肪肝的重要方法[22]。

呂海英等人的研究顯示,黑果枸杞葉總黃酮的抗氧化和降血脂作用可能與含木犀草素在內(nèi)的五種黃酮成分有關(guān)[23],而本研究進一步通過觀察血脂和抗氧化水平的變化探討木犀草素對高脂血癥大鼠肝臟脂肪變性的影響,結(jié)果表明木犀草素可以顯著降低大鼠血脂改善脂代謝紊亂,從而防止肝臟的脂肪變性,其降血脂效果與辛伐他汀相比無顯著差異。氧化應(yīng)激是指機體促氧化物和抗氧化物之間動態(tài)平衡失調(diào)所導(dǎo)致的對細胞內(nèi)大分子的氧化損傷[24],活性氧自由基過量易導(dǎo)致肝組織氧化應(yīng)激。實驗結(jié)果提示,木犀草素能夠極顯著降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物抑制脂質(zhì)過氧化,提高抗氧化酶活性從而全面提高抗氧化能力與辛伐他汀相比較弱,但無顯著差異。SOD、GSH-Px兩個抗氧化指標在干預(yù)組有所升高,但均無顯著差異,肝臟組織切片結(jié)果顯示,病理形態(tài)上木犀草素能有效改善脂肪變性,變性評分有所降低,但無顯著差異,提示可能與木犀草素的干預(yù)周期較短有關(guān),對今后進一步探討木犀草素改善肝臟脂肪變性的干預(yù)手段及機制研究提供了一定的研究基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

綜上所述,經(jīng)木犀草素干預(yù),大鼠的體重、肝系數(shù)、血清TC、TG極顯著降低(p<0.01),病理形態(tài)上肝臟脂肪變性的程度明顯改善,脂肪變性評分有所降低,但無顯著差異,同時脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物極顯著減少(p<0.01),抗氧化酶CAT活性顯著升高(p<0.05),本實驗結(jié)果提示木犀草素可以顯著降低高脂血癥大鼠的血脂水平,減輕肝臟脂肪變性程度,同時能提高抗氧化水平,改善高脂血癥帶來的氧化損傷,結(jié)合有關(guān)學(xué)說提示木犀草素可能是通過降低SD大鼠的血脂水平以及提高抗氧化能力,從而改善大鼠肝臟脂肪變性,但其效果和機制有待進一步完善,木犀草素作為常見的可食用黃酮類化合物,在預(yù)防脂肪肝、降血脂和抗氧化方面的保健功效有待進一步研究。