林東昊，茅人飛

（1.上海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海200234；2.上海瀛洲西紅花種植專業(yè)合作社，上海202155）

藏紅花為鳶尾科植物番紅花（Crocus sativus L.）的干燥柱頭，又名西紅花、番紅花，出產(chǎn)于伊朗、希臘、西班牙、印度等地，因最早是由中東地區(qū)經(jīng)西藏傳入我國，故而得名藏紅花。藏紅花是世界著名的天然香料、食用染料，也是名貴的中草藥。在我國，藏紅花作為食用香辛料和調(diào)味品收載于GB/T 12729.1-2008《香辛料和調(diào)味品名稱》，作為中藥材收載于《中華人民共和國藥典》一部[1]中。藏紅花具有獨(dú)特的感官特性和品質(zhì)，具有活血化瘀、涼血解毒、解郁安神等功效。近年來，國內(nèi)外對(duì)藏紅花進(jìn)行了多方面的研究，發(fā)現(xiàn)其具有相當(dāng)廣泛的藥理作用，能有效清除氧自由基[2-3]；治療血栓、高血脂、動(dòng)脈粥樣硬化、肝纖維化[4-7]；改善糖尿病和藥物等引起的腦功能障礙、認(rèn)知障礙[8-11]；抑制腫瘤細(xì)胞增殖[12-13]；增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[14]；改善糖尿病患者的腎功能損害[15]；保護(hù)視神經(jīng)、視網(wǎng)膜[16-17]；抗焦慮抗抑郁[18]；抵抗UVB 引起的皮膚光老化[19]；抗衰老等，在諸多方面顯示出了良好的藥理活性。藏紅花始載于唐代的《本草拾遺》（時(shí)名“郁金香”），在我國有著歷史悠久的傳統(tǒng)食用習(xí)慣，中醫(yī)藥典籍中未有毒性記錄。藏紅花是一朵花中雌蕊的三根柱頭，產(chǎn)量極低，每公斤藏紅花約有10 萬根柱頭，故彌足珍貴，有著“植物黃金”之稱。在我國，藏紅花長期依靠進(jìn)口，直至20 世紀(jì)80年代，上海地區(qū)才首先引種成功，之后在江浙等地有零星種植，并逐漸發(fā)展?，F(xiàn)在藏紅花已成為長三角地區(qū)高附加值經(jīng)濟(jì)作物進(jìn)行種植。

商品藏紅花按照來源不同分為進(jìn)口花和國產(chǎn)花兩大類，氣候條件不同，尤其是栽培方式的顯著不同，采用“大田培育大球莖，室內(nèi)培育大花蕊”的二段式栽培模式生產(chǎn)的國產(chǎn)花，其柱頭頂端喇叭口大、粗壯、長度25 mm～40 mm，色澤深紅；進(jìn)口花的柱頭頂端喇叭口較小、細(xì)弱，長度10 mm～25 mm。根據(jù)現(xiàn)代化學(xué)成分的研究，藏紅花含有糖苷、萜類、黃酮、蒽醌等一百多種化合物[20]，其中西紅花苷（藏紅花素）是其中含量最高的一類活性成分，藏紅花質(zhì)量的優(yōu)劣與西紅花苷的含量密切相關(guān)[21]，在國內(nèi)外通常以西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的含量來評(píng)價(jià)藏紅花的質(zhì)量[22]。而在藏紅花國際標(biāo)準(zhǔn)（ISO 3632-1：2011）中，以藏紅花香味強(qiáng)度（藏紅花苦素）、芳香度（藏紅花醛）和色度（藏紅花素）3 個(gè)特征參數(shù)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行藏紅花質(zhì)量分級(jí)。本研究參考了《中國藥典》一部以及藏紅花國際標(biāo)準(zhǔn)（ISO 3632-2：2010）的試驗(yàn)方法，采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測(cè)定藏紅花中西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的含量，采用紫外/可見分光光度法測(cè)定藏紅花的3 個(gè)特征參數(shù)，為評(píng)價(jià)國內(nèi)外不同來源藏紅花的品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1100 高效液相色譜儀（G1311A 四元泵、G1313A 自動(dòng)進(jìn)樣器、G1322A 在線脫氣機(jī)、G1316A 柱溫箱、G1314A 紫外檢測(cè)器）：美國Agilent 公司，GM-0.33Ⅱ隔膜真空泵：天津市騰達(dá)過濾器件廠；UV-2600紫外可見分光光度計(jì)：島津儀器（蘇州）有限公司；Sartorius BT-124S 電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；Anke TGL-16C 臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器制造廠；USC-702 超聲波清洗器：上海波龍電子設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)材料

西紅花苷-Ⅰ對(duì)照品（批號(hào)111588-201202，供含量測(cè)定用，含量以91.1%計(jì)）、西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌罚ㄅ?hào)111589-201304，供含量測(cè)定用，含量以92.4%計(jì)）：中國食品藥品檢定研究院；蒸餾水：屈臣氏集團(tuán)；甲醇：色譜純，美國TEDIA；乙醇：分析純，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司。

藏紅花供試品：來源于上海崇明廟鎮(zhèn)（1#）、上海崇明建設(shè)鎮(zhèn)（2#）、浙江湖州（3#）、浙江建德（4#）、江蘇南通（5#）、江蘇東臺(tái)（6#）、伊朗 ESFEDAN SAFFRON（7#）、伊朗BADIEE SAFFRON（8#）、散裝進(jìn)口西紅花（四川荷花池中藥材市場(chǎng)（9#）和安徽亳州中藥材市場(chǎng)（10#），經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)李俊松高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定均為鳶尾科植物番紅花（Crocus sativus L.）的干燥柱頭。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC法測(cè)定西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的含量

2.1.1 供試品溶液的制備

取已干燥藏紅花適量，置研缽中，研細(xì)，取10 mg，精密稱定，置50mL棕色容量瓶中，加稀乙醇（取乙醇529 mL，加水至1 000 mL）適量，于冰浴中避光超聲處理（58 kHz，300 W）20 min，放置至室溫，加稀乙醇定容至刻度。搖勻，16 000 r/min 離心，取上清液，即得。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備

2.1.2.1 對(duì)照品貯備液的制備

精密稱取西紅花苷-Ⅰ對(duì)照品0.014 87 g、西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌?.010 34 g，分別置25mL棕色容量瓶中，加適量稀乙醇溶解，并稀釋至刻度，制備成對(duì)照品貯備液（分別含西紅花苷-Ⅰ541.9 μg/mL，含西紅花苷-Ⅱ382.2 μg/mL）。

2.1.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

分別精密移取西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌焚A備液一定體積至同一容量瓶?jī)?nèi)，加稀乙醇，定容至刻度，依次配制成6 個(gè)不同濃度的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 色譜條件

色譜柱LunaC18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（45∶55，體積比）；檢測(cè)波長：440 nm；流速：1.0 mL/min，柱溫：30 ℃。

2.1.4 方法學(xué)考察

2.1.4.1 線性關(guān)系考察

精密移取6 個(gè)不同濃度的混合對(duì)照品溶液，按2.1.3 色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別以對(duì)照品峰面積為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得西紅花苷的回歸方程。西紅花苷線性關(guān)系結(jié)果見表1，HPLC 色譜圖見圖1。

表1 西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的線性關(guān)系試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Regression equations，correlation coefficients，and linearity ranges of crocinⅠ and crocin Ⅱ

圖1 西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of crocin-Ⅰ and crocin-Ⅱ

2.1.4.2 加樣回收試驗(yàn)

取2#供試品約15 mg，一式3 份，精密稱定，置100mL容量瓶?jī)?nèi)，加適量稀乙醇溶解，分別精密加入西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌焚A備液1.5、3.5、5.0 mL，搖勻，按2.1.1 供試品溶液制備方法，制備樣品溶液。按2.1.3 色譜條件測(cè)定，結(jié)果西紅花苷-Ⅰ的平均回收率為99.81 %，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）1.50%，西紅花苷-Ⅱ的平均回收率為97.47%，RSD 0.95%。

2.1.4.3 精密度試驗(yàn)

1）對(duì)照品溶液

移取混合對(duì)照品溶液（西紅花苷-Ⅰ濃度：27.093 μg/mL、西紅花苷-Ⅱ濃度：11.465 μg/mL），一式3 份，按2.1.3 色譜條件測(cè)定，測(cè)得對(duì)照品西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ峰面積RSD 分別為0.57%、0.53%。

2）供試品溶液

取2#供試品，一式六份，精密稱定，按2.1.1 法制備供試品溶液，按2.1.3 色譜條件測(cè)定，測(cè)得供試品中西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ含量RSD 分別為0.81%、0.80%。

2.1.5 不同來源藏紅花中西紅花苷的含量測(cè)定

取10 批次國內(nèi)外不同來源的藏紅花，按2.1.1法制備供試品溶液，按2.1.3 色譜條件測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 國內(nèi)外不同來源藏紅花中西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ含量測(cè)定結(jié)果Table 2 Quantitative determination results of crocin-Ⅰand crocin-Ⅱin saffron from different source at home and abroad

2.2 紫外/可見分光光度法測(cè)定不同來源藏紅花的3個(gè)特征參數(shù)指標(biāo)

2.2.1 供試品溶液的制備

取已干燥藏紅花適量，置研缽中，研細(xì)，取50 mg，精密稱定，置100mL容量瓶中，加水90mL于冰浴中避光超聲處理（58 kHz，300 W）20 min，放置至室溫，加水定容至刻度，搖勻。精密移取10 mL，置100mL容量瓶中，加水至刻度。搖勻，16 000 r/min 離心，取上清液，即得。

2.2.2 測(cè)定

取供試品溶液于200 nm～700 nm 波長進(jìn)行掃描，以水為空白，記錄440、330、257 nm 處的吸光度。根據(jù)吸光度、稱樣量、干燥失重計(jì)算標(biāo)示藏紅花香味、芳香度和色度的3 個(gè)特征參數(shù)，按《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)藏紅花第一部分：規(guī)格》中化學(xué)指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)判定供試品的等級(jí)分級(jí)，結(jié)果見表3，圖2。

表3 國內(nèi)外不同來源藏紅花特征參數(shù)測(cè)定結(jié)果與對(duì)應(yīng)等級(jí)Table 3 The determination results of characteristic parameters in saffron from different source at home and abroad

圖2 藏紅花特征參數(shù)測(cè)定的紫外-可見分光光譜圖Fig.2 UV/visible spectroscopic spectrum of characteristic parameters in saffron

3 結(jié)論與討論

1）藏紅花具有獨(dú)特的色、香、味，其特征參數(shù)強(qiáng)度與產(chǎn)品質(zhì)量密切相關(guān)。在藏紅花國際標(biāo)準(zhǔn)（ISO 3632-1：2011，ISO 3632-2：2010）中，采用紫外-可見分光光度法對(duì)標(biāo)示藏紅花色度、芳香度和香味的3 個(gè)特征參數(shù)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，以評(píng)定產(chǎn)品質(zhì)量等級(jí)。其中，色度以藏紅花素（西紅花苷）、芳香度以藏紅花醛、香味以藏紅花苦素為代表，最大吸收波長分別為440、330、257 nm。彌補(bǔ)了目前HPLC 法只測(cè)定西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ的局限性。本研究按該方法進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明440 nm 的最大吸收值與HPLC 的測(cè)定結(jié)果呈正相關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[23]。

2）西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ作為藏紅花的質(zhì)控指標(biāo)，在《中國藥典》一部中規(guī)定兩者含量之和不得少于10.0%（按照干燥品計(jì)算）。本研究對(duì)西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-ⅡHPLC 含量測(cè)定方法進(jìn)行了方法學(xué)考察，實(shí)驗(yàn)表明結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。國內(nèi)外不同來源的西紅花雖然含量差異較大（12.56%～23.20%），但是均符合中國藥典標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，按照藏紅花國際標(biāo)準(zhǔn)（ISO 3632-1：2011）測(cè)定了藏紅花的3 個(gè)特征參數(shù)，以色、香、味指標(biāo)成分進(jìn)行產(chǎn)品分級(jí)，國產(chǎn)西紅花的質(zhì)量明顯優(yōu)于進(jìn)口西紅花，散裝進(jìn)口花的質(zhì)量參差不齊。

3）本文研究結(jié)果表明，國產(chǎn)藏紅花中活性成分西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的含量明顯高于進(jìn)口藏紅花。這主要源于國內(nèi)外藏紅花的不同栽培模式。在中東地區(qū)，藏紅花普遍采用“露地栽培”模式，即藏紅花自種球種植于地下至開花采收整個(gè)過程，皆在大田中進(jìn)行，連續(xù)耕作。由于氣候條件的差異，我國則采用了“露地種植球莖，室內(nèi)培育鮮花”的栽培模式，并通過人工干預(yù)控制單個(gè)種球芽的數(shù)量，防止了球莖的退化，實(shí)現(xiàn)了生產(chǎn)大球莖的目標(biāo)。大球莖開出的花數(shù)量多、質(zhì)量好，造就了國產(chǎn)藏紅花優(yōu)異的品質(zhì)——國產(chǎn)藏紅花花蕊粗大、顏色深紅、活性成分含量高，而進(jìn)口花花蕊細(xì)短，顏色較淺、活性成分含量低，兩者品質(zhì)差異顯著。

4）為了準(zhǔn)確評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地藏紅花的質(zhì)量，試驗(yàn)中的國產(chǎn)藏紅花是直接從產(chǎn)地藏紅花基地或種植農(nóng)戶處購買，伊朗進(jìn)口西紅花通過其品牌代理商購買，散裝藏紅花在四川荷花池和安徽亳州中藥材市場(chǎng)采購。所有藏紅花供試品均為2014年產(chǎn)新的全紅精制花，經(jīng)鑒定均為正品。

5）藏紅花不僅是香料和色素，還具有廣泛的藥理活性，國內(nèi)外對(duì)其研究方興未艾。作為一種高附加值的經(jīng)濟(jì)作物，目前已在上海、浙江、江蘇、安徽等地引種成功，其中上海崇明為國內(nèi)西紅花的主產(chǎn)區(qū)之一，出產(chǎn)的藏紅花質(zhì)量?jī)?yōu)異，不僅西紅花苷含量高，而且其色度、芳香度和香味均達(dá)到國際西紅花等級(jí)分類高等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。本研究通過國內(nèi)外不同來源藏紅花有效成分含量的比較，為該產(chǎn)品擴(kuò)大市場(chǎng)應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支持。