張璐瑤　鮑藝今　李文璇　范明才 張津銘　李亞

【摘 要】目的：研究枳菊解郁湯對慢性不可預見性溫和應激（CUMS）小鼠抑郁樣行為的作用及其機制。方法：采用CUMS方式28天建立抑郁小鼠模型，灌胃枳菊解郁湯，通過開場、懸尾實驗檢測小鼠抑郁樣行為變化;并且檢測小鼠前腦皮層海馬血管內皮生長因子（VEGF）的表達。結果：與對照組比較，模型組小鼠的水平活動度和自發(fā)活動明顯減弱，總僵住不動時間明顯延長;小鼠海馬及前腦皮層VEGF表達水平明顯降低;枳菊解郁湯連續(xù)灌胃28后，各劑量組和氟西汀組小鼠比模型組各檢測指標均得到明顯逆轉。枳菊解郁湯中劑量組效果顯著。結論：中藥枳菊解郁湯可通過調控VEGF水平改善CUMS小鼠的抑郁樣行為。

【關鍵詞】枳菊解郁湯;慢性不可預見性應激;抑郁樣行為;VEGF

中圖分類號：Q427 文獻標識碼： A 文章編號： 2095-2457（2019）13-0079-002

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.13.036

Improvement and its Mechanism of Chinese Medicine Zhijujieyu-tang on Depression-like Behavior in Mice

ZHANG Lu-yao BAO Yi-jin LI Wen-xuan FAN Ming-cai ZHANG Jin-ming LI Ya

（School of Life Sciences，Qufu normal University，Shandong Qufu 273165，China）

【Abstract】Objective： To investigate the improvement and its mechanism of Zhijujieyu-tang on depression-like behaviors of chronic unpredictable mild stress （CUMS） mice，.Methods： The depression-like mice model was established by CUMS for 28 d.Zhijujieyu-tang and fluoxetine were intragastrically given to the mice.The depression-like behaviors were tested using the open field and tail suspension test. The changes of the Vascular endothelial growth factor （VEGF） in the hippocampus （HP） and prefrontal cortex （PFC） were evaluated by immunohistochemistry. Results： Compared with the control group， the exploration and spontaneous activity were significantly reduced， the immobility time were significantly increased， and the levels of VEGF contents in HP and PFC were apparently decreased in model group.After the mice were treated with fluoxetine and Zhijujieyu-tang， all the above indicators were significantly reversed. Zhijujieyu-tang medium dose group mice showed that it significantly effective. Conclusions： Zhijujieyu-tang improves behaviors of depressed model mice by modulating VEGF in HP and PFC.

【Key words】 Zhijujieyu-tang; CUMS; Depression-like behaviors; VEGF

研究表明，抑郁癥患者表現出情緒低落、行為絕望和認知功能障礙等主要癥狀，嚴重威脅著人類的健康。枳菊解郁湯是本課題組經單味藥精選、藥效篩選等得到的中藥復方，前期初步的研究結果表明，復方枳菊解郁湯具有一定的抗抑郁作用[1]，但其進一步的效果以及作用機制還需進一步探討。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是血管活性因子家族中的一員，能夠刺激血管內皮細胞增殖和血管形成。研究發(fā)現，VEGF在中樞神經系統(tǒng)有豐富的表達[2]，可以作為腦組織中的一種神經因子，營養(yǎng)、保護神經元，并且能夠抑制細胞凋亡[3]。抗抑郁藥物能夠促使VEGF的表達， VEGF與抑郁癥的發(fā)生密切相關，可以成為抑郁癥的生物學標志[4]。本研究中，我們在以往研究的基礎上，采用慢性不可預見性應激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）制備抑郁模型小鼠，灌胃不同劑量的枳菊解郁湯，檢測小鼠前腦皮層海馬VEGF的表達。以探討枳菊解郁對小鼠抑郁樣行為的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物

昆明品系小白鼠，2月齡，SPF級，雌雄各半，購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，動物許可證號：SCXK（魯）20140007。動物自由進食，飲水，在自然光暗周期動物環(huán)境飼養(yǎng)。

1.2 實驗藥品和使用方法

中藥復方枳菊解郁湯：枳實10g、石菖蒲15g、夜交藤20g、膽星10g、郁金15g、炒棗仁30g、勾藤30g、菊花15g、柏仁30g。依據我們實驗室先前的研究進行[5]，按人鼠等效劑量換算（生藥量175g），每日在應激前1小時給相應小組灌胃，每只小鼠0.2 ml。鹽酸氟西?。喊凑杖耸蟮刃┝繐Q算，3.6mg/kg.d，灌胃，每只小鼠0.2ml[5]。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組和CUMS模型小鼠的建立

隨機將小鼠分為對照組，模型組，西藥陽性對照組（氟西汀 3.6mg/kg.d）、枳菊解郁湯高劑量（四倍濃度）組，中劑量（二倍濃度）組，低劑量（等量濃度）組，每組10只。CUMS方式包括7種不重復的方式應激，包括：斜籠（24h），電擊足底，：在實驗箱中，每天電刺激15次，每一次10秒，刺激電壓36V;通宵照明（產生明暗的顛倒），冷水刺激（8℃冷水，共計3min），禁食（24h），高臺：將小鼠放置在鐵架臺上高160cm，每天1h;禁水（24h）。依據我們先前的研究工作進行[5]。每天隨機一種，使應激具有不可預見性，共持續(xù)28天。

1.3.2 開場實驗（open-field test）

開場實驗箱是底部5×5=25cm個正方形格子，將小鼠置于開場中央區(qū)，開始計時5min，觀察小鼠的水平活動、垂直活動等，在周邊格走動和中央格走動的狀態(tài)時間等。記錄直立次數（兩前爪抬起來遠離地面的次數）、穿越格數（四個爪完全進入下一個格內，為跨越一個水平格）、中央格停留時間。

1.3.3 懸尾實驗（tail suspension test）

實驗時，將小鼠尾端2cm處固定在試管夾上，小鼠頭頂部距離箱子底部10cm，開始計時6min，需要記錄的指標為：第一次靜止不動時間（不動潛伏期）：從開始懸掛計時至小鼠靜止不動;后4min小鼠累計不動時間。

1.3.4 小鼠各腦區(qū)神經元形態(tài)學變化及 VEGF的表達

Morris水迷宮實驗完成后，0.4%的戊巴比妥鈉腹腔麻醉小鼠，灌流取腦，經過常規(guī)的后固定，按通用的程序進行，最后做冠狀切片（片厚5μm）。用于免疫組織化學（SABC法）染色。VEGF免疫組化試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。取已制備完成的小鼠海馬各區(qū)及PFC切片，通過Olympus BX-51顯微鏡，在放大倍數為400倍的視野內，進行顯微拍照保存;利用圖像分析計算小鼠海馬和PFC的VEGF平均目標灰度值。

1.4 統(tǒng)計學數據分析

數據均采用平均數±標準誤（M±SE）。開場實驗、懸尾實驗和VEGF表達水平采用兩因素方差分析（two-way ANOVA），并以Bonferroni進行多重差異比較，及非配對t檢驗。統(tǒng)計學顯著性差異用P<0.05來表示。

2 結果

2.1 開場實驗結果

各組小鼠開場實驗結果顯示（表1）：相比于對照組，模型組小鼠的直立次數、穿越格數顯著減少（P<0.01，P<0.01），中央格停留時間顯著增多（P<0.01），表明在經過了28天的CUMS處理以后，模型組小鼠在新環(huán)境下的探究行為、自發(fā)活動明顯減少。相比于模型組，使用西藥氟西汀，及中藥灌胃28天以后，枳菊解郁湯各劑量組的開場行為指標均有顯著變化。

2.2 懸尾實驗結果

各組小鼠懸尾實驗結果顯示（表2）：相比于對照組小鼠，模型組小鼠的不動潛伏期顯著減少（P<0.01），而后4min累計不動時間顯著增加（P<0.01）;相比于模型組小鼠，中藥中劑量灌胃28天以后，小鼠的不動潛伏期顯著增加（P<0.05，P<0.01）;其他各劑量組小鼠也增多，但無顯著性差異;后4min累計不動時間，氟西汀組、枳菊解郁湯中劑量組小鼠均顯著減少（P<0.01，P<0.01），顯示出明顯的抗抑郁作用。

2.3 各組小鼠各腦區(qū)VEGF的表達

模型組小鼠VEGF陽性細胞平均目標灰度值在海馬和PFC 明顯增加（表3）（P<0.01，P<0.05）。相比于模型組小鼠，氟西汀、中藥中劑量灌胃28天以后，氟西汀組和中劑量組小鼠VEGF目標灰度值明顯降低（P<0.01，P<0.05）;表明氟西汀組和中劑量組小鼠VEGF在海馬和PFC的表達增強。

3 討論

VEGF家族有7個成員，是血管形成重要的調控因子，主要是血管內皮細胞，但對于神經系統(tǒng)的發(fā)育也是必不可少的。在腦內海馬齒狀回有高表達，可能直接促進了神經細胞的增殖。在對新型抗抑郁藥物的研發(fā)及探索其作用機理的研究中，發(fā)現抗抑郁藥物可增加海馬的VEGF 水平和內皮細胞增殖，提示抗抑郁藥物在海馬的作用途徑;如果使用特異性的抑制劑阻斷VEGF的水平，可以發(fā)現海馬的神經發(fā)生消失，抗抑郁作用也減弱[8]。

在本實驗中，CUMS應激方式建立小鼠抑郁動物模型。結果顯示建模較成功，而中藥枳菊解郁湯能明顯增加小鼠對新異環(huán)境的活動度，可改善抑郁模型小鼠的絕望情緒增加，起到一定的抗抑郁效果，且枳菊解郁湯中劑量組效果更明顯。本研究結果表明，連續(xù)給藥枳菊解郁湯處理28天，表現出明顯提高VEGF的表達水平，以減弱腦內海馬和前腦皮層神經元的功能減退。因此，可以推測CUMS導致的抑郁樣行為可能與前腦皮層和海馬VEGF表達降低密切相關，而中藥枳菊解郁湯可通過調控VEGF水平改善小鼠的抑郁樣行為。

【參考文獻】

[1]杜娜，陳倩，李洋，肖婧珊，姚夢姣，李亞.中藥復方對抑郁模型小鼠學習記憶能力及腦內SDF-1的影響[J].科技視界，2015（3）：16-17.

[2]Yasuhara T， Shingo T， Date I.The potential role of vascular endothelial growth factor in the central nervous system [J].Rev Neurosci， 2004， 15： 293-307，

[3]Marta Maria Nowacka， Ewa Obuchowicz. Vascular endothelial growth factor（VEGF）and its role in the central nervous system： A new element in the neurotrophic hypothesis of antidepressant drug action[J].Neuropeptides， 2012，46：1-10.

[4]Bergstrom A，Jayatissa MN，MOrk A，et a1.Stress sensitivity and resilience in the chronic mild stress rat model of depression; an in situ hybridization study[J].Brain Res.2008;1196：41-52.

[5]杜娜.枳菊解郁湯對抑郁模型小鼠的抗抑郁作用及其神經機制[D].山東：曲阜師范大學，2015：21-32.

[6]佗婷婷，馮正直，蔣娟等.FGF-2 和VEGF 在慢性應激抑郁大鼠前額葉皮層表達[J].第三軍醫(yī)大學學報，2012，34（13）：1265-1268.