TSP1對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷的影響研究

周才芳 曾秀琴 曾慶義

糖尿病腎病是常見(jiàn)的糖尿病微血管并發(fā)癥，其是誘導(dǎo)終末期腎病發(fā)生的主要原因之一，腎小管上皮細(xì)胞具有調(diào)節(jié)水電解質(zhì)平衡、分泌等作用，腎小管上皮細(xì)胞損傷是終末期腎病發(fā)生的重要病理變化[1-2]。研究顯示，高糖可以誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡和氧化損傷，這可能是糖尿病腎病腎組織損傷發(fā)生的機(jī)制之一[3]。血小板反應(yīng)蛋白1（thrombospondin1，TSP1）是一種與細(xì)胞凋亡、血管生成和細(xì)胞黏附等有關(guān)的多功能蛋白質(zhì)，其在人體的腦組織、血管、肺臟和心臟等組織中廣泛表達(dá)，在機(jī)體受到氧化應(yīng)激以后，其在成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞中高表達(dá)，TSP1參與腫瘤、衰老和免疫等相關(guān)疾病的發(fā)生[4-5]。目前的研究已經(jīng)顯示，TSP1在糖尿病腎病組織中高表達(dá)，TSP1表達(dá)水平與腎組織腎小管上皮細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)[6-7]。本研究以腎小管上皮細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染TSP-1 shRNA（shTSP-1），沉默TSP-1基因；以轉(zhuǎn)染慢病毒為對(duì)照，探討下調(diào)TSP1對(duì)高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞損傷的影響，為研究糖尿病腎病腎小管組織損傷提供參考。

材料與方法

一、材料

腎小管上皮細(xì)胞HK-2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞資源中心；SYBR Premix Ex Taq Realtime PCR試劑盒、PrimeScript RT reagent Kit購(gòu)自大連Takara公司；TSP1抗體購(gòu)自美國(guó)BioVision公司；TSP1 shRNA慢病毒和對(duì)照慢病毒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司；引物由金斯瑞生物科技有限公司構(gòu)建；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素 -8（interleukin-8，IL-8）含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物研究所；丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abnova公司；活化的Caspase-3（c-caspase-3）抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotech公司；Polybrene購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司。

二、方法

1.細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組：（1）對(duì)照組：腎小管上皮細(xì)胞，以5.6 mmol/L的葡萄糖細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。（2）高糖組：腎小管上皮細(xì)胞，以含有30 mmol/L的葡萄糖細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)；（3）NC＋高糖組：轉(zhuǎn)染方法同干擾＋高糖組，只是將轉(zhuǎn)染的TSP1 shRNA慢病毒換成對(duì)照慢病毒。（4）干擾＋高糖組：腎小管上皮細(xì)胞接種到24孔板內(nèi)，放在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞密度為50%時(shí)，把TSP1 shRNA慢病毒用含有10%胎牛血清的DMEM稀釋，分別添加至24孔板內(nèi)，感染復(fù)數(shù)調(diào)整為10，同時(shí)在孔內(nèi)添加 5 μg/ml的 Polybrene，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，將原培養(yǎng)液吸棄后，添加新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液（含有10%胎牛血清的DMEM），繼續(xù)培養(yǎng)3 d。用嘌呤霉素篩選10 d，取穩(wěn)定感染TSP1 shRNA慢病毒的腎小管上皮細(xì)胞，用30 mmol/L的葡萄糖細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.高糖處理后腎小管上皮細(xì)胞中TSP1表達(dá)檢測(cè)：細(xì)胞培養(yǎng)48 h以后，用Realtime PCR和Western Blot檢測(cè)細(xì)胞中 TSP1表達(dá)水平。（1）Realtime PCR：高糖組和對(duì)照組細(xì)胞分別用PBS洗滌細(xì)胞，按每 10 cm2細(xì)胞加 1 ml的 TRIZOL，用 200 μl氯仿將RNA抽提以后，分別添加500 μl的異丙醇溶液沉淀RNA，75%乙醇溶液洗滌，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD 260 nm/OD 280 nm的比值（介于1.8 ～ 2.0之間）。取適量的RNA，按照PrimeScript RT reagent Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成的cDNA保存在-80℃。用SYBR Premix Ex Taq進(jìn)行Realtime，PCR程序?yàn)椋?0℃，30 s；（95℃，5 s；60℃，30 s）×40個(gè)循環(huán)。按照2-△△CT方法計(jì)算分析TSP1的表達(dá)。GAPDH引物 Sense：5，-TGGGTGTGAACCACGAGAA-3'，Antisense：5，-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3'。TSP1 引物 Sense：5，-GGCCACTGCAGCTGATGCGATGC GTAA-3'，Antisense：5，-GGACACAACGACTGGC TTCTGGAC-3'。（2）Western Blot：高糖組和對(duì)照組細(xì)胞分別用PBS洗滌2次，加入蛋白裂解液，于冰上裂解 30 min以后，4 ℃高速，12 000×g離心10 min，各組蛋白存在于上清液中。按照BCA法分別對(duì)蛋白定量檢測(cè)以后，于-80℃保存。把蛋白樣品與等體積的上樣緩沖液混合，100 ℃煮沸反應(yīng)5 min。依照每孔中的上樣量為30 μg進(jìn)行電泳，設(shè)置濃縮膠中電壓為80 V，設(shè)置分離膠中電壓為120 V，電泳總時(shí)長(zhǎng)為2.5 h。在4 ℃條件下，以100 V電泳進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，把存在于凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。PVDF膜在5 %牛血清白蛋白中37 ℃孵育結(jié)合2 h。PVDF膜置1 : 800稀釋的TSP1抗體反應(yīng)液中，于4 ℃過(guò)夜，再放置于1 : 3 000稀釋的二抗中，37 ℃反應(yīng)1.5 h。按照ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光以后，GAPDH作為內(nèi)參，對(duì)TSP1蛋白進(jìn)行定量分析。

3.細(xì)胞中ROS水平檢測(cè)：對(duì)照組、高糖組、NC＋高糖組、干擾＋高糖組細(xì)胞培養(yǎng)48 h以后，收集細(xì)胞，用DCFH-DA法檢測(cè)細(xì)胞中ROS水平，步驟同試劑盒說(shuō)明書(shū)，以激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm和發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm的熒光分光光度計(jì)檢測(cè)熒光強(qiáng)度，用熒光強(qiáng)度表示ROS表達(dá)水平。

4.細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量檢測(cè)：對(duì)照組、高糖組、NC＋高糖組、干擾＋高糖組細(xì)胞培養(yǎng)48 h以后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，用硫代巴比妥酸法檢測(cè)培養(yǎng)液中MDA含量，步驟同試劑盒說(shuō)明書(shū)。

5.細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-8含量檢測(cè)：對(duì)照組、高糖組、NC＋高糖組、干擾＋高糖組細(xì)胞培養(yǎng)48 h以后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，用ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液上清中TNF-α、IL-8含量，步驟同試劑盒說(shuō)明書(shū)。

6.細(xì)胞凋亡檢測(cè)：對(duì)照組、高糖組、NC＋高糖組、干擾＋高糖組細(xì)胞培養(yǎng)48 h以后，收集細(xì)胞，分別用300 μl的緩沖液將各組細(xì)胞懸浮以后，依次添加 Annexin V-FITC和PI工作液各 5 μl，置于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)凋亡情況，在檢測(cè)前每組再添加200 μl的結(jié)合緩沖液。

7.細(xì)胞中c-caspase-3蛋白表達(dá)水平檢測(cè)：對(duì)照組、高糖組、NC＋高糖組、干擾＋高糖組細(xì)胞培養(yǎng)48 h以后，收集細(xì)胞，用Western Blot方法檢測(cè)細(xì)胞中c-caspase-3蛋白表達(dá)水平，步驟同上。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析，細(xì)胞中TSP1 mRNA和蛋白表達(dá)量、細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-8、MDA含量等用表示，兩組均數(shù)差異比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組均數(shù)間差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞中TSP1表達(dá)：結(jié)果見(jiàn)圖1和表1中所示，高糖處理可以誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞中TSP1轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。

2.TSP1 siRNA下調(diào)高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞中TSP1表達(dá)：結(jié)果見(jiàn)圖2和表2中所示，在腎小管上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)染TSP1 shRNA后，可以明顯下調(diào)高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞中TSP1轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。

圖1 Western Blot測(cè)定高糖對(duì)腎小管上皮細(xì)胞中TSP1表達(dá)影響

表1 高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞中TSP1表達(dá)（±s）

表1 高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞中TSP1表達(dá)（±s）

分組 重復(fù)次數(shù) TSP1 mRNA TSP1蛋白對(duì)照組 3 1.00 0.36±0.05高糖組 3 2.65±0.14 0.75±0.09 t 值 20.414 6.561 P值 ＜ 0.01 ＜ 0.01

圖2 Western Blot檢測(cè)TSP1 shRNA對(duì)高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞中TSP1表影響

表2 TSP1 shRNA下調(diào)高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞中TSP1表達(dá)水平（±s）

表2 TSP1 shRNA下調(diào)高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞中TSP1表達(dá)水平（±s）

注：與高糖組比較，aP ＜ 0.05；與 NC ＋高糖組比較，bP ＜ 0.05

分組 重復(fù)次數(shù) TSP1 mRNA TSP1蛋白高糖組 3 1.00 0.73±0.09 NC＋高糖組 3 1.01±0.12 0.71±0.06干擾＋高糖組 3 0.38±0.06ab 0.25±0.06ab F值 65.117 43.373 P值 ＜ 0.01 ＜ 0.01

3.下調(diào)TSP1減少高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞炎癥因子分泌：結(jié)果見(jiàn)表3中所示，高糖處理后的腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-8含量升高；下調(diào)TSP1可以下調(diào)高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-8含量。

4.下調(diào)TSP1減輕高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞氧化損傷：結(jié)果見(jiàn)表4，圖3中所示，高糖處理后的腎小管上皮細(xì)胞中ROS水平升高，同時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量也升高；下調(diào)TSP1可以明顯抑制高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞中ROS表達(dá)，減少細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量。

5.下調(diào)TSP1減少高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞凋亡：結(jié)果見(jiàn)圖4和表5中所示，高糖處理后的腎小管上皮細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞中c-caspase-3蛋白水平升高；下調(diào)TSP1可以下調(diào)高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞凋亡率和c-caspase-3蛋白水平（圖5）。

表3 下調(diào)TSP1對(duì)高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-8 含量影響（±s）

表3 下調(diào)TSP1對(duì)高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-8 含量影響（±s）

注：與對(duì)照組比，aP ＜ 0.05；與高糖組比較，bP ＜ 0.05；與 NC＋高糖組比較，cP ＜ 0.05

分組 重復(fù)次數(shù) TNF-α（ng/ml）IL-8（ng/ml）對(duì)照組 3 20.14±1.36 12.98±1.63高糖組 3 45.91±2.87a 25.42±3.26a NC＋高糖組 3 46.32±5.24 26.91±2.74干擾＋高糖組 3 34.20±2.06bc 18.75±1.62bc F值 43.825 21.155 P值 ＜ 0.01 ＜ 0.01

表4 下調(diào)TSP1對(duì)高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞中ROS和培養(yǎng)液中MDA含量影響（±s）

表4 下調(diào)TSP1對(duì)高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞中ROS和培養(yǎng)液中MDA含量影響（±s）

注：與對(duì)照組比，aP ＜ 0.05；與高糖組比較，bP ＜ 0.05；與 NC＋高糖組比較，cP ＜ 0.05

分組 重復(fù)次數(shù) ROS MDA含量（nmol/ml）對(duì)照組 3 5.20±0.63 1.05±0.13高糖組 3 9.65±0.49a 2.36±0.21a NC＋高糖組 3 9.71±0.62 2.30±0.42干擾＋高糖組 3 6.96±0.50bc 1.63±0.10bc F值 45.652 18.595 P值 ＜ 0.01 ＜ 0.01

表5 下調(diào)TSP1對(duì)高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞凋亡和c-caspase-3蛋白水平影響（±s）

表5 下調(diào)TSP1對(duì)高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞凋亡和c-caspase-3蛋白水平影響（±s）

注：與對(duì)照組比，aP ＜ 0.05；與高糖組比較，bP ＜ 0.05；與 NC＋高糖組比較，cP ＜ 0.05

分組 重復(fù)次數(shù) 凋亡率（%）c-caspase-3對(duì)照組 3 4.69±0.51 0.26±0.03高糖組 3 24.56±2.38a 0.85±0.09a NC＋高糖組 3 23.92±2.69 0.86±0.07干擾＋高糖組 3 18.48±1.23bc 0.45±0.04bc F值 69.632 69.187 P值 ＜ 0.01 ＜ 0.01

圖3 熒光顯微鏡下觀察下調(diào)TSP1對(duì)高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞中ROS含量影響（×200）

圖4 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡變化

圖5 Western Blot檢測(cè)細(xì)胞中c-caspase-3蛋白水平

討 論

糖尿病腎病是一種常見(jiàn)的引起終末腎疾病的原因之一，高糖環(huán)境下的腎小管上皮細(xì)胞功能損傷是糖尿病腎病發(fā)生的關(guān)鍵[8]。高血糖可以誘導(dǎo)腎組織中氧化應(yīng)激和炎癥損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9-11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高糖處理后的腎小管上皮細(xì)胞凋亡率升高，說(shuō)明成功構(gòu)建了糖尿病腎病腎小管上皮細(xì)胞損傷模型。

TSP1是一種糖蛋白，由3個(gè)相同的肽鏈構(gòu)成的外基質(zhì)糖蛋白，其分子量約為145 kDa，因最初是在血小板純化中發(fā)現(xiàn)而得名[12]。TSP1蛋白含有6個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，分別發(fā)揮血小板調(diào)控、血管生成、誘導(dǎo)凋亡、鈣離子結(jié)合和細(xì)胞黏附等作用[13]。正常情況下，TSP1在腦組織、肺臟等多種組織中表達(dá)，內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等在受到炎癥、氧化應(yīng)激等刺激后能夠高表達(dá)TSP1。TSP1可促進(jìn)氧化損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[14]。很多研究顯示，TSP1是一種與纖維化疾病發(fā)生有關(guān)的調(diào)控因子，在糖尿病腎病、糖尿病心肌病等組織中高表達(dá)。TSP1還能夠誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高糖處理后的腎小管上皮細(xì)胞中TSP1表達(dá)上調(diào)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，均提示，TSP1在糖尿病腎病腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。

腎小管上皮細(xì)胞是腎臟組織的重要組成部分，在受到外界因素刺激后，能夠分泌大量的炎癥因子，促進(jìn)組織炎癥反應(yīng)[16]。TNF-α在糖尿病腎病腎組織中表達(dá)上調(diào)，其可以由腎小管上皮細(xì)胞分泌，是腎組織炎癥反應(yīng)的促進(jìn)因子[17]。IL-8也是一種促炎因子，高血糖刺激腎臟后可以誘導(dǎo)IL-8的分泌和表達(dá)[18]。TSP1是一種炎癥誘導(dǎo)因子，其表達(dá)缺失可以減輕組織和細(xì)胞炎癥[19]。本組資料干擾＋高糖組細(xì)胞培養(yǎng)液中的TNF-α和IL-8明顯低于NC＋高糖組，提示下調(diào)TSP1具有抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞分泌TNF-α和IL-8、減輕炎癥反應(yīng)的作用。

研究表明，炎癥與氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)，炎癥因子可以刺激細(xì)胞中ROS產(chǎn)生，同時(shí)細(xì)胞中ROS過(guò)度積累可以誘導(dǎo)炎癥因子分泌。細(xì)胞中過(guò)量的ROS能夠誘導(dǎo)細(xì)胞中脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化，產(chǎn)生大量的MDA[20]。另外，ROS還可以激活細(xì)胞中Caspase凋亡蛋白的激活，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生，Caspase-3活化是細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆反應(yīng)的標(biāo)志[21]。本組資料干擾＋高糖組的細(xì)胞中ROS水平明顯低于NC＋高糖組；培養(yǎng)液中MDA含量亦明顯降低，提示下調(diào)TSP1的表達(dá)可以下調(diào)高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞中ROS水平，減少細(xì)胞中MDA合成，同時(shí)下調(diào)TSP1還可以抑制高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞中Caspase-3活化，減少細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能通過(guò)抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激而減少細(xì)胞凋亡。

本組資料表明，下調(diào)TSP1可能通過(guò)抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞分泌炎癥因子、減輕炎癥損傷并減少細(xì)胞凋亡，TSP1可能是治療糖尿病腎病的潛在靶點(diǎn)，為以后研究TSP1在糖尿病腎病中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。